pod cod 的測(cè)定方法

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1、三、過(guò)氧化氫酶的活性測(cè)定——紫外吸收法【原理】H2O2在240nm波長(zhǎng)下有強(qiáng)烈吸收，過(guò)氧化氫酶能分解過(guò)氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度(A240)隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測(cè)量吸光率的變化速度即可測(cè)出過(guò)氧化氫酶的活性?！緝x器與用具】紫外分光光度計(jì)；離心機(jī)；研缽；250ml容量瓶1個(gè)；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml試管3支；恒溫水浴；【試劑】0.2mol/LpH7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/LH2O2（用0.1mol/L高錳酸鉀標(biāo)定）?！痉椒ā?.酶液提取：稱(chēng)取新鮮小麥葉片或其它植物組織0.5g置研缽中，加入2～3ml4℃下預(yù)冷的pH7.0磷

2、酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，并用緩沖液沖洗研缽數(shù)次，合并沖洗液，并定容到刻度?；旌暇鶆?qū)⒘科恐?℃冰箱中靜置10min，取上部澄清液在4000rpm下離心15min，上清液即為過(guò)氧化氫酶粗提液。5℃下保存?zhèn)溆谩?.測(cè)定：取10ml試管3支，其中2支為樣品測(cè)定管，1支為空白管，按表40-2順序加入試劑。表40-2紫外吸收法測(cè)定H2O2樣品液配置表管號(hào)S1S2S3粗酶液(ml)0.20.20.2pH7.8磷酸(ml)1.51.51.5蒸餾水(ml)1.01.01.025℃預(yù)熱后,逐管加入0.3ml0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即記時(shí)，并迅速倒入

3、石英比色杯中，240nm下測(cè)定吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共測(cè)4min，待3支管全部測(cè)定完后，按下式計(jì)算酶活性。3.結(jié)果計(jì)算：以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活單位（u）。過(guò)氧化氫酶活性(u/gFW/min)=式中A240=AS0－AS0—加入煮死酶液的對(duì)照管吸光值；AS1,AS2—樣品管吸光值；Vt—粗酶提取液總體積（ml）；V1—測(cè)定用粗酶液體積（ml）；FW—樣品鮮重（g）；0.1—A240每下降0.1為1個(gè)酶活單位（u）；t—加過(guò)氧化氫到最后一次讀數(shù)時(shí)間（min）。氮藍(lán)四唑（NBT）法測(cè)定超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧化酶（superoxide

4、dismutase，SOD）普遍存在于動(dòng)、植物體內(nèi)，是一種清除超氧陰離子自由基的酶。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)超氧物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光下的還原作用來(lái)確定酶活性大小。在有氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生O2，可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲腙，后者在560nm處有最大吸收。而SOD可清除O2，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說(shuō)明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計(jì)算出酶活性大小。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料；水稻或小麥葉片（二）儀器設(shè)備：1.高速臺(tái)式離心機(jī)；2.分光光度計(jì)；3.微量進(jìn)樣器；4.熒光燈（反應(yīng)試管處照

5、度為4000Lx）；5.試管或指形管數(shù)支。（三）試劑　1.0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.8）；2.130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：稱(chēng)1.9399gMet用磷酸緩沖液定容至100ml；3.750μmol/L氮藍(lán)四唑溶液：稱(chēng)取0.06133gNBT用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存；4.100μmol/LEDTA－Na2溶液：稱(chēng)取0.03721gEDTA－Na2用磷酸緩沖液定容至1000ml；5.20μmol/L核黃素溶液：稱(chēng)取0.0753g核黃素用蒸餾水定容至1000ml避光保存。三、實(shí)驗(yàn)步驟1.酶液提取　取一定部位的植物葉片（視需要定，去葉脈）0.5g于預(yù)

6、冷的研缽中，1ml預(yù)冷的磷酸緩沖液在冰浴上研磨成漿，加緩沖液使終體積為5ml。取1.5～2ml于1000rpm下離心20min，上清液即為SOD粗提液。2.顯色反應(yīng)　取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支為測(cè)定管，另2支為對(duì)照管，按下列加入各溶液：試劑（酶）用量（ml）終濃度（比色時(shí)）0.05mol/L磷酸緩沖液1.5130mmol/LMet溶液0.313mmol/L750μmol/LNBT溶液0.375μmol/L100μmol/LEDTA－Na2液0.310μmol/L20μmol/L核黃素0.320μmol/L酶液0.052支對(duì)照管以緩沖液代替酶液蒸餾水0.25總體積3

7、.0混勻后將1支對(duì)照管置暗處，其它各管于4000Lx日光下反應(yīng)20min（要求各管受光情況一致，溫度高時(shí)間縮短，低時(shí)延長(zhǎng)）。3.SOD活性測(cè)定與計(jì)算　至反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的對(duì)照管做空白，分別測(cè)定其它各管的吸光度。四、結(jié)果計(jì)算已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50％為一個(gè)酶活性單位表示，按下式計(jì)算SOD活性。SOD總活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt)上式中，SOD比活力＝SOD總活性蛋白質(zhì)含量式中SOD總活性以每克鮮重酶單位表示；比活力單位以酶單位／mg蛋白表示A