《動(dòng)物基因工程》課件

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1、第十一章動(dòng)物基因工程www.haust.edu.cn1第一節(jié)基因工程概述理論上的三大發(fā)現(xiàn)DNA為遺傳物質(zhì)：Avery的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)和DNA半保留復(fù)制機(jī)制遺傳密碼與中心法則www.haust.edu.cn2技術(shù)上的三大發(fā)明1.限制性內(nèi)切酶和連接酶：DNA的“手術(shù)刀”與“縫紉機(jī)”2.載體：運(yùn)送遺傳物質(zhì)的工具，如質(zhì)粒、病毒等3.逆轉(zhuǎn)錄酶：從mRNA到DNA，使真核基因制備成為可能www.haust.edu.cn3www.haust.edu.cn4www.haust.edu.cn5www.haust.e

2、du.cn6www.haust.edu.cn7www.haust.edu.cn8www.haust.edu.cn9www.haust.edu.cn10www.haust.edu.cn113、基因工程的內(nèi)容目的基因的獲得目的基因與載體的連接成重組DNA分子重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞篩選重組克隆基因表達(dá)與產(chǎn)物分離www.haust.edu.cn12基因操作中的工具酶手術(shù)刀－限制性核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶縫紉機(jī)－連接酶復(fù)印機(jī)－DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶第二節(jié)基因操作中的工具酶www.haust.edu.cn13一、限制性內(nèi)切酶的概述（

3、一）概念限制性核酸內(nèi)切酶簡(jiǎn)稱限制性內(nèi)切酶，是一類能識(shí)別雙鏈DNA中特定核苷酸序列并具有專一切割位點(diǎn)的脫氧核糖核酸水解酶。主要存在于細(xì)菌、霉菌中，至今已分離到1000種以上，搞清識(shí)別序列的有300種以上。www.haust.edu.cn14（二）限制性內(nèi)切酶命名規(guī)則限制酶的命名從其來(lái)源微生物的拉丁名中摘取，即由其屬名的第一個(gè)字母(大寫(xiě))與種名的第一、二兩個(gè)字母(小寫(xiě))組成酶的基本命名，若酶的產(chǎn)生菌由株系之分，則有4個(gè)或4個(gè)以上拉丁字母組成，其第四個(gè)字母之后表示株系。如EcoRI來(lái)源于Echerichia.coliRY13Ba

4、mHI來(lái)源于B.amyloliquefacienswww.haust.edu.cn15HindIIHaemophilus(屬名)Influenzae(種名)d(株系)羅馬數(shù)字限制性內(nèi)切酶命名舉例www.haust.edu.cn16類別反應(yīng)必須因子專一性活性I型S-腺苷基蛋氨酸，ATP，Mg2+識(shí)別部位和切點(diǎn)不同，無(wú)特定切割位點(diǎn)內(nèi)切甲基化II型Mg2+切斷識(shí)別部位或其附近的特定部位只有限制酶活性III型ATP，Mg2+識(shí)別部位和切點(diǎn)不同，但切斷特定部位內(nèi)切甲基化（三）限制性內(nèi)切酶分類www.haust.edu.cn17www

5、.haust.edu.cn18（四）II型限制性內(nèi)切酶的特性（1）II型限制酶的識(shí)別特異性?回文識(shí)別序列II型限制酶的識(shí)別序列大多是具有雙重對(duì)稱結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu),或稱回文序列(PalindromicSequence)www.haust.edu.cn19（2）識(shí)別特定的核苷酸序列，其長(zhǎng)度一般為4－8個(gè)核苷酸且呈二重對(duì)稱。（3）具有特定的酶切位點(diǎn)，即限制性內(nèi)切酶在其識(shí)別序列的特定位點(diǎn)對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行切割，由此產(chǎn)生特定的酶切末端。www.haust.edu.cn20識(shí)別序列(位點(diǎn))雙鏈DNA分子上能識(shí)別的特定核苷酸序列被識(shí)別的堿基序列

6、通常具有雙軸對(duì)稱性，即回文序列(PalindromicSequence)。EcoRI的識(shí)別序列www.haust.edu.cn21二、DNA聚合酶（一）DNA聚合酶(DNAPolymerase)的基本特性能夠?qū)⒚撗鹾颂呛塑账徇B續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’-OH末端催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生引物從膜版上的解離作用。DNA-OHDNA-(pdN)n＋nPPidATP，dTTP，dCTP，dGTP，Mg2＋DNA聚合酶www.haust.edu.cn22大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ1．E.coliDNA聚合酶Ⅰ的活性①5‘-

7、-3’DNA聚合酶活性。②5‘--3’外切核酸酶活性。③3'--5'外切酶活性。www.haust.edu.cn232．E.coliDNA聚合酶Ⅰ的用途①利用E.coliDNA聚合酶Ⅰ的5‘--3’外切核酸酶活性，可用切口平移法（nicktranslation）標(biāo)記DNA，所有DNA聚合酶中只有此酶有此反應(yīng)。②用于cDNA克隆中的第二鏈，即單純的DNA聚合活性。但由于具有5‘--3’外切活性，現(xiàn)在已不再使用，而改用Klenow酶和反轉(zhuǎn)錄酶（詳見(jiàn)后面）。③對(duì)3‘突出端的DNA作末端標(biāo)記（交換或置換反應(yīng)），但是此反應(yīng)用T4或T

8、7DNA聚合酶效果會(huì)更好。www.haust.edu.cn24（二）KlenowDNA聚合酶無(wú)5’→3’外切活性有聚合活性有3’→5’外切活性由于沒(méi)有5'--3'外切活性，使用范圍進(jìn)一步擴(kuò)大www.haust.edu.cn25KlenowDNA聚合酶用途①補(bǔ)平3’凹端DNA。②抹平DNA3’凸端。③通過(guò)