響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基

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1、響應(yīng)面分析法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基主要內(nèi)容1.香菇多糖與提取方法簡(jiǎn)介2.Plackett-Burman設(shè)計(jì)法與響應(yīng)面分析法3.實(shí)驗(yàn)材料與方法4.Plackett-Burman優(yōu)化培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)5.響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基組成6.結(jié)論1.香菇多糖與提取方法簡(jiǎn)介香菇多糖：是一種生理活性物質(zhì)。它具有抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能和刺激干擾素形成等功能。提取方法：從香菇子實(shí)體或經(jīng)深層發(fā)酵后的發(fā)酵液中提取。香菇子實(shí)體生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，產(chǎn)量和多糖得率均較低。而深層發(fā)酵培養(yǎng)香菇菌絲體不僅發(fā)酵液中含有與子實(shí)體相當(dāng)或更高的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)還可利用農(nóng)副產(chǎn)品作原料，成本低，周期短，易于大規(guī)模生產(chǎn)，

2、因此已得到廣泛應(yīng)用于重視。但目前香菇菌絲體發(fā)酵水平較低，通過(guò)優(yōu)化條件以提高多糖含量是發(fā)酵過(guò)程中急需解決的問(wèn)題。2.Plackett-Burman設(shè)計(jì)法與響應(yīng)面分析法同：都是20世紀(jì)中葉后發(fā)展起來(lái)的的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。能用較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)推算出目標(biāo)值的優(yōu)化條件，優(yōu)化效率高。異：Plackett-Burman試驗(yàn)就是篩選實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，主要針對(duì)因子數(shù)較多，且未確定眾因子相對(duì)于相應(yīng)變量的顯著性，采用的試驗(yàn)方法。響應(yīng)面分析法是一種優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件尋優(yōu)的方法，它通過(guò)試驗(yàn)設(shè)計(jì)、建模、檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷暮线m性，尋求最佳組合條件的眾多試驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化香菇多糖培養(yǎng)基方法用Plac

3、kett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選影響香菇產(chǎn)多糖的主要因素用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基做響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)回歸模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，確定最優(yōu)培養(yǎng)基最陡爬坡法確定因素水平用統(tǒng)計(jì)軟件SAS8.0進(jìn)行回歸擬合，建立回歸模型與方程3.實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1菌種來(lái)源：香菇135，本實(shí)驗(yàn)室分離保存（浙江慶元）3.2試劑：馬鈴薯購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，魚(yú)粉為浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院提供，其余所需的主要試劑均為分析純，3.3培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法斜面培養(yǎng)基：采用PDA培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基組成為（%）：葡萄糖2，蛋白胨0.25，酵母膏0.25，初始pH自然，121℃滅菌30min。初始發(fā)酵培養(yǎng)基成分為（

4、%）：葡萄糖1.5，酵母膏0.5，MgSO4·7H2O0.1。初始pH5.5，121℃滅菌30min。斜面菌種轉(zhuǎn)接至裝有100mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置回轉(zhuǎn)式搖床180r/min，25℃培養(yǎng)5d。然后將菌絲體無(wú)菌條件下打散制成種子懸液，以10%的接種量轉(zhuǎn)接入100mL/250mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，回轉(zhuǎn)式搖床180r/min，25℃培養(yǎng)6d后結(jié)束。3.4粗多糖提取將發(fā)酵菌懸液離心（4,000r/min，20min），分別收集上清液和菌體。上清液中加入無(wú)水乙醇至75%（v/v），冰箱保存過(guò)夜，再經(jīng)離心（8,000r/min，10min），取沉淀用于胞外多

5、糖測(cè)定。菌體洗滌后，懸浮于一定體積的去離子水中，超聲波破壁（300Hz，10min)，高速離心（10,000r/min，10min）收集上清液，處理過(guò)程同上，用于胞內(nèi)多糖測(cè)定。粗多糖為胞內(nèi)多糖與胞外多糖之和。1.5粗多糖測(cè)定粗多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法（Duboisetal.1956）4.Plackett-Burman優(yōu)化培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4.1Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選主要影響因子本實(shí)驗(yàn)選用N=12的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)葡萄糖（A）、魚(yú)粉（B）、VB1（C）、NaCl（D）、FeSO4（E）、MgSO4（F）、KH2PO4（G

6、）和初始pH（H）8個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素取高（+）低（-）兩個(gè)水平，高水平約為低水平的1.25倍，響應(yīng)值為總粗多糖產(chǎn)量（Y），實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，因素水平取值、效應(yīng)及顯著性分析見(jiàn)表2。表1Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果BACK表2Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果由表可知，在香菇菌株135產(chǎn)多糖過(guò)程中葡萄糖、魚(yú)粉和KH2PO4這3個(gè)因素對(duì)多糖產(chǎn)量顯著，可考慮作為主要因素進(jìn)一步做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。4.2最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果要得到響應(yīng)面擬合方程，必須要先逼近最佳值區(qū)域。而本方法以實(shí)驗(yàn)值的變化方向?yàn)榕榔路较颍鶕?jù)各因素效應(yīng)值大小確定變化步長(zhǎng)。根據(jù)表

7、2分析結(jié)果，確定不顯著因素的水平，表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)的因素取低值水平，正效應(yīng)的取高值。顯著因素的變化步長(zhǎng)及方向的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表明（表3），第3組產(chǎn)量最高，因此以第3組的水平作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)，即葡萄糖2%，魚(yú)粉1.0%，KH2PO40.1%。0.50.051.5最佳組5.響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基組成5.1Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析：依據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)和最陡爬坡法實(shí)驗(yàn)確定的因素與水平。采用Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)產(chǎn)多糖發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)表5Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)結(jié)果3個(gè)中

8、心實(shí)驗(yàn)效果佳5.2二次回歸模型擬合和方