質粒載體介紹(質?；咎匦院头N類及標記基因)

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1、質粒載體介紹（質?；咎匦院头N類及標記基因）2010-01-2513:25:29來源：易生物實驗瀏覽次數：6084網友評論0條一、質粒的基本特性二、標記基因三、質粒載體的種類關鍵詞：質粒載體質粒載體標記基因一、質粒的基本特性1．質粒的復制通常一個質粒含有一個與相應的順式作用控制要素結合在一起的復制起始區(qū)（整個遺傳單位定義為復制子）。在不同的質粒中，復制起始區(qū)的組成方式是不同的，有的可決定復制的方式，如滾環(huán)復制和θ復制。在大腸桿菌中使用的大多數載體都帶有一個來源于pMB1質粒或ColE1質粒的復制起始位點。圖3-1是其復制

2、其始示意圖。在復制時，首先合成前RNAⅡ，即前引物，并與DNA形成雜交體；而后RNaseH切割前RNAⅡ，使之成為成熟的RNAⅡ，并形成三葉草二級結構，該引物引導質粒的復制。形成的RNAⅠ可控制RNAⅡ形成二級結構，同時Rop增強RNAⅠ的作用，從而控制質粒的拷貝數。削弱RNAⅠ和RNAⅡ之間相互作用的突變，將增加帶有pMB1或（ColE1）復制子的拷貝數。圖3-1帶pMB1（或ColE1）復制起點的質粒在復制起始階段所產生的轉錄的方向及其粗略大小。2．質粒的拷貝數質?？截悢捣譃閲乐斝团c松馳型。嚴謹型質粒每個細胞中拷貝數

3、有限，大約1～幾個；松馳型質?？截悢递^多，可達幾百。表5-1就是不同類的質粒與復制子及拷貝數的大致關系。表3-1：質粒載體及其拷貝數質粒復制子拷貝數pBR322及其衍生質粒pMB115～20pUC系列質粒及其衍生質突變的pMB1500～700粒pACYC及其衍生質粒p15A10～212pSC101及其衍生質粒pSC101～5ColE1ColE115～20pUC系列質粒的復制單位來自質粒pMB1，但其拷貝數較高。pMB1質粒的復制并不需要質粒編碼的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期較長的酶（DNA聚合酶Ⅰ，DNA聚合酶

4、Ⅲ），依賴于DNA的RNA聚合酶，以及宿主基因dnaB、dnaC、dnaD和danZ的產物。因此，存在抑制蛋白質合成并阻斷細菌染色體復制的氯霉素或壯觀霉素等抗生素時，帶有pMB1（或ColE1）復制子的質粒將繼續(xù)復制，最后每個細胞中可積聚2～3千個質粒。3．質粒的不相容性兩個質粒在同一宿主中不能共存的現象稱質粒的不相容性，它是指在第二個質粒導入后，在不涉及DNA限制系統(tǒng)時出現的現象。不相容的質粒一般都利用同一復制系統(tǒng)，從而導致不能共存于同一宿主中。兩個不相容性質粒在同一個細胞中復制時，在分配到子細胞的過程中會競爭，隨機挑

5、選，微小的差異最終被放大，從而導致在子細胞中只含有其中一種質粒。而不相容群指那些具有不相容性的質粒組成的一個群體，一般具有相同的復制子。在大腸桿菌中現已發(fā)現30多個不相容群，如ColE1和pMB1，pSC101和p15A。4．轉移性質粒具轉移性。它是指在自然條件下，很多質?？梢酝ㄟ^稱為細菌接合的作用轉移到新宿主內。它需要移動基因mob，轉移基因tra，順式因子bom及其內部的轉移缺口位點nic。二、標記基因按其用途可將標記基因分為選擇標記基因和篩選標記基因。選擇標記用于鑒別目標DNA（載體）的存在，將成功轉化了載體的宿主

6、挑選出來，篩選標記可用于將特殊表型的重組子挑選出來。（一）選擇標記抗生素抗性基因是目前使用最廣泛的選擇標記。1．氨芐青霉素抗性基因（Ampicillinresistancegene,ampr）氨芐青霉素抗性基因是基因操作中使用最廣泛的選擇標記，絕大多數在大腸桿菌中克隆的質粒載體帶有該基因。青霉素可抑制細胞壁肽聚糖的合成，與有關的酶結合并抑制其活性，抑制轉肽反應。氨芐青霉素抗性基因編碼一個酶，該酶可分泌進入細菌的周質區(qū)，抑制轉肽反應并催化β-內酰胺環(huán)水解，從而解除了氨芐青霉素的毒性。青霉素是一類化合物的總稱，其分子結構由側

7、鏈R-CO-和主核6-氨基青霉烷酸（6-APA）兩部分組成。在6-APA中有一個飽和的噻唑環(huán)（A）和一個β-內酰胺環(huán)，6-APA為由L-半脫氨酸和纈氨酸縮合成的二肽。2．四環(huán)素抗性基因（Tetracyclineresistancegene,tetr）四環(huán)素可與核糖體30S亞基的一種蛋白質結合，從而抑制核糖體的轉位。四環(huán)素抗性基因編碼一個由399個氨基酸組成的膜結合蛋白，可阻止四環(huán)素進入細胞。pBR322質粒除了帶有氨芐青霉素抗性基因外，還帶有四環(huán)素抗性基因。3．氯霉素抗性基因（chloramphenicolresista

8、ncegene,Cmr,cat）氯霉素可與核糖體50S亞基結合并抑制蛋白質合成。目前使用的氯霉素抗性基因來源于轉導性P1噬菌體（也攜帶Tn9）。cat基因編碼氯霉素乙酰轉移酶，一個四聚體細胞質蛋白（每個亞基23kDa）。在乙酰輔酶A存在的條件下，該蛋白催化氯霉素形成氯霉素羥乙酰氧基衍生物，使之不能與核糖體結合。4．卡