基因克隆質(zhì)粒載體

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1、第六講基因克隆的質(zhì)粒載體中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所基因克隆的質(zhì)粒載體一、導(dǎo)言1．質(zhì)粒是一類引人注目的亞細(xì)胞有機(jī)體其結(jié)構(gòu)比病毒還要簡單，既無蛋白質(zhì)外殼，也無細(xì)胞外生命周期，只能在寄主細(xì)胞內(nèi)增殖，并隨著寄主細(xì)胞的分裂而被遺傳下去。2．質(zhì)粒的類型多種多樣F質(zhì)粒：F因子或性質(zhì)粒(Sexplasmid)，它能夠使寄主染色體上的基因與F因子(Ffactor)一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的寄主受體細(xì)胞中去。R質(zhì)粒：通稱抗藥性因子(Resistantfactor,Rfactor)，編碼一種或數(shù)種抗菌素抗性基因，并能將此抗性轉(zhuǎn)移到缺乏該質(zhì)的

2、適宜的受體細(xì)胞中去。Col質(zhì)粒：所謂Col質(zhì)粒，即是一種產(chǎn)生大腸桿菌素的因子，編碼控制大腸桿菌素合成的基因。大腸桿菌素可使不帶Col質(zhì)粒的親緣關(guān)系密切的細(xì)菌菌株致死。3．質(zhì)粒載體70年代在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的一類最普遍使用的基因克隆載體。二、質(zhì)粒的一般特性1．質(zhì)粒DNA(細(xì)菌質(zhì)粒定義*1.大腸桿菌的質(zhì)粒是獨(dú)立于寄主染色體以外的自主復(fù)制的共價(jià)、閉合、環(huán)形的雙鏈DNA分子(covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)。除了酵母的殺傷質(zhì)粒(Killerplasmid)是RNA質(zhì)粒外，所有的質(zhì)粒都是質(zhì)粒DNA。但是質(zhì)

3、粒DNA的復(fù)制又必須依賴于寄主提供核酸酶及蛋白質(zhì)。*2.質(zhì)粒DNA分子大小文獻(xiàn)中有3種說法：小的僅有103KD，僅能編碼2-3種蛋白質(zhì)；大的可達(dá)105KD，兩者相差上百倍。1Kb～200Kb(Sambroketal.)5Kb～400Kb(Lehninger)MD(megadaltons)=106D(兆道爾頓)1.5Kb≈1MD*3.質(zhì)粒DNA與寄主染色體DNA間的關(guān)系一般情況下，質(zhì)粒DNA可持續(xù)地處于寄主染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下又可以可逆地整合到寄主染色體上，并隨之一道復(fù)制和細(xì)胞分裂而傳到后代。*4.質(zhì)粒DNA的分子

4、構(gòu)型SC構(gòu)型：即共價(jià)閉合環(huán)形的cccDNA所呈現(xiàn)的超螺旋構(gòu)型。走在凝膠的最前面。OC構(gòu)型：即開環(huán)DNA(ocDNA)所呈現(xiàn)的構(gòu)型，其中一條DNA鏈保持完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈上則出現(xiàn)有一個(gè)至數(shù)個(gè)的缺口。走在凝膠的最后方部位。L構(gòu)型：發(fā)生雙鏈斷裂形成的線性DNA分子所呈現(xiàn)的構(gòu)型，通稱L型。走在凝膠中間部位。2．質(zhì)?？寺≥d體必須具備的條件(三種共同的組成部分)①具有復(fù)制區(qū)或復(fù)制因子(replicator)復(fù)制因子：是指一段特定的質(zhì)粒DNA，它含有質(zhì)粒DNA的復(fù)制起點(diǎn)(ori)(originofreplication)，以及編碼質(zhì)粒

5、DNA和質(zhì)粒復(fù)制所需要的DNA序列結(jié)構(gòu)。*注意復(fù)制因子(replicator)和復(fù)制子(replicon)之間在概念上的差別。復(fù)制子(replicon)：系指含有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)的DNA復(fù)制單位，例如細(xì)菌染色體、病毒基因組、質(zhì)?；蚪M等，凡其DNA能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單元均稱為復(fù)制子。*在一般的情況下，一個(gè)質(zhì)粒只含有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的復(fù)制子。但在少數(shù)的情況下，由融合產(chǎn)生的質(zhì)粒也會含有兩個(gè)復(fù)制子，但其中只有一個(gè)有活性。②具有抗菌素抗性基因一種理想的質(zhì)?？寺≥d體應(yīng)具有兩種抗菌素抗性基因，以便為寄主細(xì)胞提供易于檢測的表型

6、性狀作為選擇記號，而且在有關(guān)的限制酶識別位點(diǎn)上插入外源DNA片段之后形成的重組質(zhì)粒，至少仍要保留一個(gè)強(qiáng)選擇記號。③具有若干限制酶單一識別位點(diǎn)這樣的分子結(jié)構(gòu)特性，可以滿足基因克隆的需要，而且在其中插入適當(dāng)大小的外源DNA片段之后，應(yīng)不影響質(zhì)粒DNA的復(fù)制功能。④具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)這類質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)在于：a.低分子量質(zhì)粒易于操作，克隆了外源DNA片段之后(一般不超過15Kb)仍可有效地轉(zhuǎn)化給受體細(xì)胞；b.含有較高的拷貝數(shù)有利于質(zhì)粒DNA的制備，增加克隆DNA片段(基因)的產(chǎn)量；c.低分子量的質(zhì)粒分子中對某種限制酶具多重識別

7、位點(diǎn)的機(jī)率也就相應(yīng)下降；3．質(zhì)粒DNA編碼的表型①質(zhì)粒DNA的分子量較小，僅占細(xì)胞染色體的一小部分，一般約為3%。②質(zhì)粒DNA盡管分子量小，但卻編碼著重要的遺傳性狀：a.抗性特征：抗菌素抗性、重金屬抗性、毒性陰離子抗性，以及其它抗性。b.代謝特征：抗菌素及細(xì)菌素合成；簡單的碳水化合物(例如乳糖、蔗糖等)的新陳代謝；復(fù)雜碳水化合物(甲苯、苯胺)及鹵代化合物的新陳代謝；蛋白質(zhì)新陳代謝；……固N(yùn)作用；H2S的合成；檸檬酸的利用；歐文氏菌的色素形成；產(chǎn)堿桿菌的反硝化活性；產(chǎn)堿桿菌和歐文氏菌的硫氨素的合成；c.修飾寄主生活方式的因子：大

8、腸桿菌腸毒素的合成；金黃色葡萄球菌剝脫性毒素的合成；炭疽桿菌外毒素的合成；蘇蕓金芽孢桿菌l-內(nèi)毒素的合成；破傷風(fēng)桿菌神經(jīng)毒素的合成；大腸桿菌定居抗原的合成；大腸桿菌及鏈球菌等的溶血素的合成；腸道細(xì)菌的血清抗性；耶爾森菌的毒力；炭疽芽孢桿菌的莢膜的合成；大腸桿菌中鐵的運(yùn)轉(zhuǎn)。d.