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《第2章 基因克隆的載體——質(zhì)粒和噬菌體》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、第2章基因克隆的載體——質(zhì)粒和噬菌體載體：攜帶外源DNA進入宿主細胞的工具。一、載體的功能：1.運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞2.為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力3.為外源基因的擴增或表達提供條件二、載體應(yīng)具備的條件：1.具有對受體細胞的可轉(zhuǎn)移性2.具有與特定受體細胞相適應(yīng)的復(fù)制位點或整合位點3.長度盡可能小，以提高其載裝能力4.具有多種單一的酶切位點5.具有合適的選擇性標記附圖：圖3-1自主復(fù)制型載體和附加載體的擴增方式2.1質(zhì)?！ ≠|(zhì)粒是存在于細菌細胞質(zhì)中獨立于染色體而自主復(fù)制的共價、封閉、環(huán)狀雙鏈DNA
2、分子（CovalentlyclosedCircularDNA,cccDNA），并不是細菌生長所必需的，但可以賦予細菌某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力。分子量在1-200kb之間。一、質(zhì)粒的基本特性：?。ㄒ唬┳灾鲝?fù)制性 質(zhì)粒DNA攜帶有自己的復(fù)制起始區(qū)（ori）以及一個控制質(zhì)粒拷貝數(shù)的基因，因此它能獨立于宿主細胞的染色體DNA而自主復(fù)制。不同的質(zhì)粒在宿主細胞內(nèi)的拷貝數(shù)也不同，少則幾個多則幾百個不等，當(dāng)然由于質(zhì)粒上并沒有復(fù)制酶的基因，所以其復(fù)制需要使用宿主細胞復(fù)制染色體DNA的多種酶群?！。ǘ┎幌嗳菪浴 ?/p>
3、利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒（RNAIRNAIIRop因子）如果被導(dǎo)入同一細胞中，它們在復(fù)制及隨后分配到子細胞的過程中，就會彼此競爭，它們在單細胞中的拷貝數(shù)也會有差異，拷貝多的復(fù)制更快，結(jié)果在細菌繁殖幾代之后，細菌的子細胞中絕大多數(shù)都含有占優(yōu)勢的質(zhì)粒，因而這兩種質(zhì)粒中只能有一種長期穩(wěn)定地留在細胞中，這就是所謂的質(zhì)粒不相容性?！。ㄈ┛蓴U增性 質(zhì)粒就其復(fù)制方式而言分為兩類：松弛型復(fù)制及嚴謹型復(fù)制。pMB1或ColEI類質(zhì)粒復(fù)制子的復(fù)制完全依靠宿主細胞提供的半衰期較長的復(fù)制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，
4、RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的產(chǎn)物），因此在蛋白質(zhì)合成中斷時，質(zhì)粒復(fù)制能持續(xù)合成，這樣當(dāng)用氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細菌染色體復(fù)制時，帶有pMB1或ColEI復(fù)制子的質(zhì)粒將利用豐富的原料大量復(fù)制，最后每個細胞可以積聚2000-3000個拷貝，這叫做氯霉素擴增。但另外兩種質(zhì)粒（psc101和p15A）和的復(fù)制子的復(fù)制受質(zhì)粒上編碼的蛋白因子的正調(diào)節(jié)。氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成后，這類質(zhì)粒便不能持續(xù)復(fù)制?！。ㄋ模┛赊D(zhuǎn)移性 在天然條件下，很多天然質(zhì)粒都可以通過細菌接合作用從一種宿主細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到
5、另外一種宿主內(nèi)，這種轉(zhuǎn)移依賴于質(zhì)粒上的tra基因產(chǎn)物。二、質(zhì)粒的構(gòu)建（一）天然存在的兩種質(zhì)?！ 。?）colE1宿主細菌大腸桿菌6.5kb松弛型復(fù)制20-30/cell。 ?。?）pSC101宿主細菌沙門氏菌8.8kb嚴謹型復(fù)制5copy/cell標記基因為Tcr質(zhì)粒的命名p小寫代表質(zhì)粒；后面有兩至三個大寫字母代表發(fā)現(xiàn)者或構(gòu)建者的姓名。（二）質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的 天然質(zhì)粒往往存在著這樣或那樣的缺陷，因而不適合用作基因工程的載體必須對之進行改造構(gòu)建： ?。?）加入合適的選擇標記基因，如兩個以上，易于用作選擇
6、?。?）增加或減少合適的酶切位點，便于重組 ?。?）縮短長度，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量 ?。?）改變復(fù)制子，變嚴緊為松弛，變少拷貝為多拷貝 （5）根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件 方法就是重組，拼拼接接，挖肉補瘡。三、質(zhì)粒的分類?。ㄒ唬└鶕?jù)質(zhì)?；蚓幋a的特性將質(zhì)粒分為五大類： 致育（fertility）質(zhì)粒/F質(zhì)粒：僅攜帶轉(zhuǎn)移（tra）基因，并且除了能夠促進質(zhì)粒有性結(jié)合的轉(zhuǎn)移外，不再具備其他的特征，如大腸桿菌的F質(zhì)粒?！ ∧退幮裕╮esistance）質(zhì)粒/R質(zhì)粒：攜帶有
7、能夠賦予宿主細菌對某一種或多種抗菌藥的耐藥性的基因，如抗氯霉素、青霉素或水銀。如RP4，發(fā)現(xiàn)于假單胞桿菌?！ ol質(zhì)粒（colplasmid）：編碼大腸桿菌素，一種能夠殺死其他細菌的蛋白，如存在于E.coli中的CoE1。圖3-2利用抗性基因進行重組子的篩選 降解質(zhì)粒（degradativeplasmid）:使宿主菌能夠代謝一些通常情況下無法利用的分子，如：甲苯，水楊酸，例如，假單胞菌中的TOL質(zhì)粒?！ 《拘再|(zhì)粒（virulenceplasmid）：賦予宿主菌致病性，比如根瘤農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒（T
8、iplasmid），能夠在雙子葉植物中誘導(dǎo)冠癭瘤。2.2噬菌體一、λDNA載體（一）λ噬菌體的分子生物學(xué)λ噬菌體是大腸桿菌的噬菌體，它由外殼蛋白和λ-DNA組成1)λ-DNA的物理圖譜 λ-DNA為線狀雙鏈DNA分子，兩端各有一個12核苷酸的互補單鏈（粘性末端）GGGCGGCGACCT,CCCGCCGCTGGA，稱為cos區(qū)，全長48.5kb。特點是功能相近的基因在基因組中聚集在一起。例如，所有的編碼外殼蛋白
