基因克隆的質(zhì)粒載體

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1、基因克隆的質(zhì)粒載體　　在大腸桿菌的各種菌體中找到了許多種不同類型的質(zhì)粒，其中已經(jīng)作了比較詳盡研究的主要有F質(zhì)粒、R質(zhì)粒和Col質(zhì)粒?！　、貴質(zhì)粒又叫F因子或性質(zhì)粒（sexplasmid）。它們能夠使寄主染色體上的基因和F質(zhì)粒一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體細(xì)胞中去?！　、赗質(zhì)粒通稱抗藥性因子。它們編碼有一種或數(shù)種抗菌素抗性基因，并且通常能夠?qū)⒋朔N抗性轉(zhuǎn)移到缺管該質(zhì)粒的適宜的受體細(xì)胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力?！　、跜ol質(zhì)粒即所謂產(chǎn)生大腸桿菌素因子。它們編碼有控制大腸桿菌素合成的基因。大腸桿菌是一類可以使不帶有Col質(zhì)粒的親緣關(guān)系密切的細(xì)菌菌株致死的蛋白質(zhì)。第一節(jié)質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性

2、一、質(zhì)粒DNA細(xì)菌質(zhì)粒是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一類獨立于染色體的自主復(fù)制的遺傳成份。絕大多數(shù)的質(zhì)粒都是由環(huán)形雙DNA組成的復(fù)制子（圖4-1）。26　　質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀，但在一定的條件下又可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代?！　…h(huán)形雙鏈的質(zhì)粒DNA分子具有三種不同的構(gòu)型：　　1．當(dāng)其兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)時，稱之為共價閉合環(huán)形DNA（cccDNA），這樣的DNA通常呈現(xiàn)超螺旋的SC構(gòu)型；　　2．如果兩條多核苷酸鏈中只有一條保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個缺口時，稱之為開環(huán)DNA（ocDNA），此即OC構(gòu)

3、型；　　3．若質(zhì)粒DNA經(jīng)過適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶切割之后，發(fā)生雙鏈斷裂形成線性分子（IDNA），通稱L構(gòu)型（見圖4-2）?！　≡诃傊悄z電泳中，不同構(gòu)型的同一種質(zhì)粒DNA，盡管分子量相同，仍具有不同的電泳遷移就緒。其中走在最前沿的是SC　DNA，其后依次是LDNA和OC26DNA（圖4-3）。　　凡經(jīng)改建而適于作為基因克隆載體的所有質(zhì)粒DNA分子，都必定包括如下三種共同的組成部分，即復(fù)制基因（replicator）、選擇性記和克隆位點。二、質(zhì)粒DNA編碼的表型　　質(zhì)粒DNA僅占細(xì)胞染色體組的1%～3%左右，但卻編碼著一些重要的非染色體控制的遺傳性狀。其中對抗菌素的抗性最質(zhì)粒的最重要的編碼特

4、性之一。三、質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移?。?）質(zhì)粒的類型　革蘭陰性細(xì)菌的質(zhì)?？梢苑殖山雍闲秃头墙雍闲偷膬煞N類群?！　〗雍闲偷馁|(zhì)粒（conjugativeplasmid），又叫自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒。它們除了具有自主復(fù)制所必須的遺傳信息之外，還帶有一套控制細(xì)菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因?！　》墙雍闲偷馁|(zhì)粒（non-conjugativeplasmid），亦叫不能自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒。它們雖然具有自主復(fù)制的遺傳信息，但失去了控制細(xì)胞配驪和接合轉(zhuǎn)移的基因，因此是不能夠從一個細(xì)胞自我轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞?！。?）F質(zhì)?！∮纸蠪因子，即致育因子（fertilityfactor）的簡稱，是在某些大腸桿菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種最有代表性的單

5、拷貝的接合型質(zhì)粒。F質(zhì)粒有三種不同的存在方式：　?。╥）F+細(xì)胞：以染色體外環(huán)形雙鏈質(zhì)粒DNA形式存在，其上不帶有任何來自寄主染色體的基因或DNA區(qū)段?！　。╥i）F′細(xì)胞：以染色體外環(huán)形雙鏈質(zhì)粒DNA形式存在，同時在其上還攜帶著細(xì)菌的染色體基因或DN區(qū)段。　?。╥ii）Hfr細(xì)胞（高頻重組細(xì)胞）26：以線性DNA形式從不同位點整合到寄主染色體。　　F因子是雄性決定因子，所以F+細(xì)胞又叫雄性細(xì)胞，與此相應(yīng)的F-細(xì)胞則叫做雌性細(xì)胞。F+細(xì)胞的表面可以形成一種叫做性須（pilus）的結(jié)構(gòu)，它促進(jìn)雄性細(xì)胞同雌性細(xì)胞進(jìn)行配對。在合適的條件下，將雄性細(xì)胞和雌性細(xì)胞混合培養(yǎng)，由于性須的作用，就會形成雌-

6、雄細(xì)胞配對。我們稱這種過種為細(xì)菌的接合作用（conjugation）。配對之后F-受體細(xì)胞獲得了F因子，也變成為F+細(xì)胞?！　∮蒄因子整合到染色體而成的Hfr細(xì)胞，就可能相發(fā)寄主染色體發(fā)生高頻轉(zhuǎn)移。這是一種可逆的過程，在一定的條件下，Hfr細(xì)胞又可重新變參展F+或F′細(xì)胞。質(zhì)粒的主要類型見表4-1?！。?）質(zhì)粒DNA的接合轉(zhuǎn)移　?、偌?xì)胞交配對的形成雄性細(xì)胞的性須頂端與受體細(xì)胞表面接觸之后，便會迅速收縮，把給體細(xì)胞與受體細(xì)胞拉在一起。因此，性須在確立配對細(xì)胞表面間的緊密接觸方面，起著至關(guān)重要的作用。但是，大腸桿菌雄性細(xì)胞是不會同其它的亦帶有F質(zhì)粒的細(xì)胞發(fā)生配對作用的，因為traS和traT編碼

7、的“表面排斥”蛋白質(zhì)，使此種細(xì)胞無法成為接合作用的受體。這就決定了雄性細(xì)胞只能同不具F因子的雌性細(xì)胞配對的特異性。　　②質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移F質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移是從轉(zhuǎn)移起點oriT開始的。當(dāng)細(xì)胞交配對建立之后，TraY和TraI蛋白質(zhì)首先在oriT位點作單鏈切割，隨后缺口鏈在其游離的5′-端的引導(dǎo)下轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并作為模板合成互補(bǔ)鏈，形成新的質(zhì)粒分子。于是受體細(xì)胞便轉(zhuǎn)變成為具有F因子的雄性細(xì)胞如圖4-4。26四、