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《何水林版基因工程第三章分子克隆載體》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、第三章?分子克隆載體（Molecularcloningvectors）周毅峰2013春在基因工程中，通常是把外源DNA片斷利用運載工具送入生物細(xì)胞。攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的這種工具叫做載體(Vector)。載體(Vector)載體的本質(zhì)是DNA。經(jīng)過人工構(gòu)建的載體，不但能與外源基因相連接，導(dǎo)入受體細(xì)胞，還能利用本身的調(diào)控系統(tǒng)，使外源基因在新細(xì)胞中復(fù)制以致功能的表達(dá)。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章
2、分子克隆載體基因工程中常用的主要載體質(zhì)粒(Plasmid)，主要指人工構(gòu)建的質(zhì)粒噬菌體載體柯斯質(zhì)粒(cosmid)單鏈DNA噬菌體M13動物病毒人工染色體(artificialchromosome)2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體載體的功能及特征載體的功能運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體載體應(yīng)具備的條件具有針對受體細(xì)胞的親緣
3、性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）具有合適的篩選標(biāo)記具有較高的外源DNA的載裝能力具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點或整合位點2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體pBR3224363bp2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體克隆載體（cloningvector）對目的基因克隆，建立DNA文庫和cDNA文庫，其上有復(fù)制子即可按功能分類表達(dá)載體（expressionvector）使目的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)，既
4、有復(fù)制子，又有強啟動子穿梭載體（shuttlevector）可以在原核細(xì)胞中復(fù)制，也可在真核細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體第一節(jié)質(zhì)粒（Plasmid）質(zhì)粒是一種獨立于染色體外的小分子環(huán)狀DNA，一般大小約106~108D，可自身復(fù)制和表達(dá)。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體基因克隆載體的質(zhì)粒DNA分子，必定包括：復(fù)制基因、選擇性
5、記、克隆位點。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體1質(zhì)粒的基本特性2質(zhì)粒DNA的分離純化4重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體3質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體1.1質(zhì)粒DNA的構(gòu)型兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，稱為共價閉合環(huán)形DNA（cccDNA），通常呈現(xiàn)超螺旋的SC構(gòu)型只有一條DNA鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個缺口，稱為開環(huán)DNA（ocDNA），此即OC構(gòu)型線性分子DNA（IDNA），稱為L構(gòu)型1質(zhì)粒的基本特性20
6、12年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體1.2質(zhì)粒DNA分子大小質(zhì)粒宿主分子大小/kbpPbs藍(lán)藻1.5ColE1大腸桿菌6.4ColV2大腸桿菌140Ti致癌農(nóng)桿菌330左右PV21三葉草根瘤菌700F大腸桿菌942012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體1.3質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對
7、應(yīng)關(guān)系根據(jù)在每個細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）的多少，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringentplasmid）在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)少的質(zhì)粒，1－數(shù)個拷貝松弛型質(zhì)粒（relaxedplasmid）在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒，10個拷貝以上2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體低或單拷貝質(zhì)粒的復(fù)制必需由復(fù)制子本身編碼一個必不可少的順式作用蛋白(repA)來對復(fù)制起點作正調(diào)控作用，如psc101等，同時其復(fù)制受宿主蛋白合成的影響。所以這些質(zhì)粒的拷貝數(shù)不能通過諸如氯霉
8、素等蛋白質(zhì)合成抑制劑來增加拷貝數(shù)1）松弛復(fù)制型多拷貝質(zhì)粒（pMB1或ColE1等）的復(fù)制不受宿主菌蛋白合成的影響的影響；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)合成不能進(jìn)行時，復(fù)制依然進(jìn)行2)嚴(yán)緊型復(fù)制2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體Howmanycopiescanbereplicated?2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體NegativecontrolpositivecontrolanswersRepr
