基因工程第三章克隆載體

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1、第二節(jié)病毒載體virusvector什么是病毒?病毒：由DNA（或RNA）和外殼蛋白組成，經(jīng)包裝后成為病毒顆粒。1/311噬菌體的溶原性周期和溶菌性周期天然的轉(zhuǎn)基因過程2/3121.λ噬菌體克隆載體λ噬菌體（Bacteriophagelambda）頭部尾部尾絲3/313（1）λDNA：線狀，雙鏈DNA，48502bp（linear，double-strandedDNA，dsDNA）cos位點(diǎn)：λDNA兩端各有12bp的粘性末端，兩者互補(bǔ)，進(jìn)入宿主后可連成環(huán)狀DNA。1.1、λ噬菌體的性質(zhì)4/314宿主細(xì)胞頭部尾部尾絲λDNA5/3156/316（2

2、）λDNA有56個(gè)限制酶識別序列，50個(gè)基因，左臂，右臂和中央片段，中央片段可以被替代。Cos頭部合成尾部合成刪除與結(jié)合重組DNA合成晚期控制阻遏阻遏早期控制溶菌成熟左臂leftarm右臂rightarm中央片段centralstuffer7/317(3)、λ噬菌體的侵染8/3181.2、λ噬菌體載體的構(gòu)建（1）切去λDNA的中央片段BamHIsitesLeftarmRightarmCOSCOSBamHICOSCOSLRCOSCOSLR回收9/319（2）插入標(biāo)記基因（markergene）例如：lacZ基因，轉(zhuǎn)化的菌斑在含有X-gal的培養(yǎng)基因上

3、表現(xiàn)籃色.10/3110（3）插入外源基因（foreigngene）可插入20kb的目的基因。11/3111部分消化DNAligase基因組DNACOSCOSLRAimgeneLRAimgeneCOS12/3120kb的DNA片段12（4）建立λDNA體外包裝系統(tǒng)（packingsystem）包裝后方可侵染.13/3113重組的噬菌體體外包裝14/31142、柯斯質(zhì)粒載體（Cosmidvector）2.1含義：含有λ噬菌體粘性末端（cos位點(diǎn)）的質(zhì)粒，又稱粘粒2.2特點(diǎn)：帶有cos位點(diǎn)4-6kb有標(biāo)記基因常用于構(gòu)建cDNA文庫（cDNAlibrar

4、y）可攜帶大的基因片段，45kb。2.3構(gòu)建過程15/3115體外包裝16/3116第三節(jié)、染色體定位整合載體基因整合平臺系統(tǒng)：包括整合平臺和定位整合克隆載體。整合平臺：受體細(xì)胞基因組上給定的一個(gè)DNA區(qū)域，是外源DNA定位整合的位置。定位整合克隆載體：質(zhì)粒克隆載體，有一個(gè)或兩個(gè)與整合平臺DNA區(qū)域同源的DNA片段。17/3117一、定位整合模式ForeignDNAHomologoussequenceVectorDNAGenomeDNAofreceptorcellGenomeDNAofreceptorcellHomologoussequenceVe

5、ctorDNA18/3118與受體細(xì)胞和同源序列長短有關(guān)，一般較低(10-7-10-3).會出現(xiàn)隨機(jī)插入，篩選困難。二、定位整合效率19/31191定義酵母人工染色體：具有酵母染色體的著絲粒（cen4）、自主復(fù)制序列(ARS1)和端粒等功能序列的質(zhì)粒載體。可容納1000至3000kb的DNA大片段。第四節(jié)YAC克隆載體20/3120是Yeast和E.coli.的穿梭載體(shuttlevector)YAC在E.coli.中按質(zhì)粒形式復(fù)制，轉(zhuǎn)入酵母菌后按染色體形式復(fù)制。穿梭載體:含有不止一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)、能攜帶插入序列在不同種類宿主細(xì)胞中繁殖的載體2

6、1/3121著絲粒端粒自主復(fù)制序列22/31端粒E.coli.originofreplicationmarkergenesinyeastmarkergenesInE.coli.markergenesinyeast22外源基因EcoRI23/31YAC克隆載體的構(gòu)建232應(yīng)用2.1構(gòu)建基因組文庫（genomelibrary）：特別適于動植物等基因組較大的生物。2.2、基因治療(Genetherapy)：可復(fù)制，安全24/3124一、啟動子探針型載體質(zhì)粒載體，含有一個(gè)檢測部件（一個(gè)無轉(zhuǎn)錄功能的標(biāo)記基因和克隆位點(diǎn)）第五節(jié)、特殊用途的載體25/3125Th

7、egenewhichcannotexpressGFPgeneMultiplecloningsitesAMPr26/3126二、誘導(dǎo)型表達(dá)載體：啟動子在特殊的誘導(dǎo)條件下才有轉(zhuǎn)錄活性。外源基因處于這樣的啟動子下，必須有誘導(dǎo)條件才能表達(dá)。優(yōu)點(diǎn)：易于人的控制，安全，可用于基因治療。27/3127三、組織特異性表達(dá)載體只能在特定組織中表達(dá)的載體。乳腺組織特異性表達(dá)載體：利用牛、羊等動物的乳腺產(chǎn)生藥物。腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)載體：基因治療藥物的定向?qū)搿?8/3128四、分泌型表達(dá)載體基因表達(dá)的蛋白可分泌到胞外，利于產(chǎn)物分離純化。29/3129本章主要內(nèi)容小結(jié)：常

8、用質(zhì)粒載體、Ti質(zhì)粒載體。病毒載體染色體定位整合載體酵母人工染色體載體特殊用途的克隆載體上述載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及構(gòu)建方法及原理