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《何水林版基因工程 第三章分子克隆載體.ppt》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、第三章?分子克隆載體（Molecularcloningvectors）周毅峰2013春在基因工程中，通常是把外源DNA片斷利用運(yùn)載工具送入生物細(xì)胞。攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的這種工具叫做載體(Vector)。載體(Vector)載體的本質(zhì)是DNA。經(jīng)過人工構(gòu)建的載體，不但能與外源基因相連接，導(dǎo)入受體細(xì)胞，還能利用本身的調(diào)控系統(tǒng)，使外源基因在新細(xì)胞中復(fù)制以致功能的表達(dá)。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆
2、載體基因工程中常用的主要載體質(zhì)粒(Plasmid)，主要指人工構(gòu)建的質(zhì)粒噬菌體載體柯斯質(zhì)粒(cosmid)單鏈DNA噬菌體M13動(dòng)物病毒人工染色體(artificialchromosome)2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體載體的功能及特征載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體載體應(yīng)具備的條件具有針對受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)
3、移性）具有合適的篩選標(biāo)記具有較高的外源DNA的載裝能力具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體pBR3224363bp2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體克隆載體（cloningvector）對目的基因克隆，建立DNA文庫和cDNA文庫，其上有復(fù)制子即可按功能分類表達(dá)載體（expressionvector）使目的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)，既有復(fù)制子，又有強(qiáng)啟動(dòng)子穿
4、梭載體（shuttlevector）可以在原核細(xì)胞中復(fù)制，也可在真核細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體第一節(jié)質(zhì)粒（Plasmid）質(zhì)粒是一種獨(dú)立于染色體外的小分子環(huán)狀DNA，一般大小約106~108D，可自身復(fù)制和表達(dá)。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體基因克隆載體的質(zhì)粒DNA分子，必定包括：復(fù)制基因、選擇性記、克隆位點(diǎn)。2012年3月基因
5、工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體1質(zhì)粒的基本特性2質(zhì)粒DNA的分離純化4重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體3質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體1.1質(zhì)粒DNA的構(gòu)型兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，稱為共價(jià)閉合環(huán)形DNA（cccDNA），通常呈現(xiàn)超螺旋的SC構(gòu)型只有一條DNA鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個(gè)缺口，稱為開環(huán)DNA（ocDNA），此即OC構(gòu)型線性分子DNA（IDNA），稱為L構(gòu)型1質(zhì)粒的基本特性2012年3月基因工程中－GeneEngin
6、eering第三章分子克隆載體2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體1.2質(zhì)粒DNA分子大小質(zhì)粒宿主分子大小/kbpPbs藍(lán)藻1.5ColE1大腸桿菌6.4ColV2大腸桿菌140Ti致癌農(nóng)桿菌330左右PV21三葉草根瘤菌700F大腸桿菌942012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體1.3質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應(yīng)關(guān)系根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）的多少，
7、質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringentplasmid）在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)少的質(zhì)粒，1－數(shù)個(gè)拷貝松弛型質(zhì)粒（relaxedplasmid）在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒，10個(gè)拷貝以上2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體低或單拷貝質(zhì)粒的復(fù)制必需由復(fù)制子本身編碼一個(gè)必不可少的順式作用蛋白(repA)來對復(fù)制起點(diǎn)作正調(diào)控作用，如psc101等，同時(shí)其復(fù)制受宿主蛋白合成的影響。所以這些質(zhì)粒的拷貝數(shù)不能通過諸如氯霉素等蛋白質(zhì)合成抑制劑來增加拷貝數(shù)1）松弛復(fù)制型多拷貝質(zhì)粒
8、（pMB1或ColE1等）的復(fù)制不受宿主菌蛋白合成的影響的影響；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)合成不能進(jìn)行時(shí)，復(fù)制依然進(jìn)行2)嚴(yán)緊型復(fù)制2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體Howmanycopiescanbereplicated?2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆載體NegativecontrolpositivecontrolanswersRepr
