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1、雙歧桿菌的分離與鑒定一、實驗背景雙歧桿菌(Bifidobacterium)系1899年巴斯德研究院的Tissier首先在以母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中發(fā)現(xiàn)并分離出來[1]。雙歧桿菌是人體腸道內(nèi)重要的益生菌之一多加點好的作用，還具有抗腫瘤、抗衰老、營養(yǎng)等作用。雙歧桿菌為專性厭氧菌，對營養(yǎng)條件要求苛刻，活性保持相對比較困難。因此，研究一種適宜的分離方法具有現(xiàn)實的意義。為了豐富雙歧桿菌菌種資源及開發(fā)雙桿菌產(chǎn)品，本實驗主要是了進(jìn)行雙歧桿菌分離、純化、生化鑒定以及PCR檢測，進(jìn)行對雙歧桿菌的分離與鑒定。二、實驗步驟（一）材料1、分離源母
2、乳喂養(yǎng)的健康嬰兒糞便2、培養(yǎng)基和試劑TPY培養(yǎng)基、生理鹽水、生化鑒定這一塊還要改一改革蘭染料（結(jié)晶紫染色液、盧戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸復(fù)紅液）、厭氧袋（硼氫化鉀、檸檬酸、碳酸氫鈉）、生化鑒定試劑管（F6PPK試驗、乳糖、葡萄糖、硫化氫、纖維二糖、棉籽糖、山梨醇、淀粉、葡萄糖酸鹽、木糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、蜜二糖、甘露醇、吲哚、硝酸鹽還原、明膠液化、阿拉伯糖、過氧化氫、聯(lián)苯胺）、雙蒸水、TaKaRaTaq、10×PCRBuffer(Mg2+Plus)、dNTPMixture(各2.5mM)、16sRNA90
3、916F、16sRNA90916R、3、設(shè)備PCR儀、紫外分光光度儀、凝膠電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、恒溫培養(yǎng)箱、厭氧罐、無菌操作臺、冰箱、顯微鏡、接種環(huán)等微生物實驗室所需的常規(guī)設(shè)備。（二）實驗內(nèi)容1、樣品的采集與處理（1）用滅菌棉簽取母乳喂養(yǎng)的健康嬰兒的糞便約lg，放入裝有9ml生理鹽水的無菌試管中，充分振蕩搖勻，做成1∶10的均勻稀釋液。另取1mL滅菌的移液管吸取1∶10的稀釋液注入到滅過菌的含有9mL生理鹽水的試管中，充分振蕩搖勻，做成1∶100的均勻稀釋液。按上述操作順序，依次做成1×10-3～1×10-7梯度的
4、均勻稀釋液。（2）分別取1×10-1~1×10-7梯度的均勻稀釋液在TPY培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線分離（預(yù)實驗），37℃厭氧培養(yǎng)24~48h觀察哪幾個梯度的雙歧桿菌分離的比較好，然后進(jìn)行試驗。（例如1×10-5~1×10-7)3、分離培養(yǎng)用接種環(huán)取a、b、c三種梯度的稀釋液中的雙歧桿菌進(jìn)行TPY培養(yǎng)基平板劃線分離，每個梯度的稀釋液劃2塊平皿，并做空白對照。37℃厭氧培養(yǎng)24~48h。4、革蘭染色和鏡檢雙歧桿菌經(jīng)24~48h培養(yǎng)后多數(shù)形成直徑為0.5~1mm、凸起、邊緣整齊、乳白色或灰白色不透明的菌落，菌體寬約0.5μm，長
5、度在1~6μm之間，有彎曲和分叉現(xiàn)象，形成雙歧桿菌特有的“V”或“Y”結(jié)構(gòu)[1]。挑選平板上菌落較小、光滑、凸圓、邊緣整齊、白色或乳白色不透明、質(zhì)地柔軟的特征菌落[2]，取菌落的一半進(jìn)行涂片，然后進(jìn)行革蘭氏染色，如果挑選的菌落是革蘭氏陽性、顯微鏡下具有雙歧桿菌形態(tài)特征，如菌體形狀不太規(guī)則，呈弧形、兩端大小不一、V形或Y形的菌落，那么取菌落的另一半進(jìn)行劃線平板分離培養(yǎng)，再革蘭染色和鏡檢。重復(fù)上述實驗2~3次，直至出現(xiàn)分離出純凈的單個菌落。5、生化鑒定取分離純化的雙歧桿菌菌落，分別接種在以上幾種生化鑒定試劑管內(nèi)，并用液態(tài)石
6、蠟油封口，觀察其反應(yīng)結(jié)果。6、PCR法檢測從步驟4中分離出來的純凈單菌落進(jìn)行大面積的一區(qū)劃線，37℃厭氧培養(yǎng)24~48h。取培養(yǎng)好的雙歧桿菌接種到裝有雙蒸水的離心管中，搖勻，離心5000r/min,5min,棄上清,用雙蒸水重懸后同上離心,雙蒸水再次重懸,煮沸15min,離心12000r/min,5min，取上清,即DNA。配置PCR擴(kuò)增體系：10×PCRBuffer(Mg2+Plus)15μl、TaKaRaTaq0.75μl、dNTPMixture(各2.5mM)12μl、16sRNA90916F3μl、16sRNA
7、90916R3μl、雙蒸水111.75μl，各成分依次加入到滅菌2ml離心管中（超凈臺內(nèi)操作），離心10s.同時以裝有49ul體系、1ul雙蒸水無菌離心管作為陰性對照。將配制好的PCR體系放置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR循環(huán)參數(shù)及擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5min,30個循環(huán)(94℃30s,53℃30s,72℃90s),72℃延伸8min。將5ul的6×LoadingBuffer和1ul的PCR產(chǎn)物充分混合均勻，注入到凝膠孔中，同時在注入4ul1kbmarker。電泳30min，置于全自動凝膠成像分析系統(tǒng)下，觀察處理得到的
8、條帶。三、實驗結(jié)果雙歧桿菌特征樣品稀釋度菌數(shù)菌落特征個體特征顏色邊緣大小透明度高度形狀革蘭染色1×10-5（a）1×10-5（b）1×10-6（a）1×10-6（b）1×10-7（a）1×10-7（b）對照組雙歧桿菌生化鑒定結(jié)果菌種項目1×10-5（a）1×10-5（b）1×10-6（a）1×10-6（b）1×10-7（a）1×1
