限制酶精美生物醫(yī)學(xué)

限制酶精美生物醫(yī)學(xué)

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1、基因操作技術(shù)的基本條件C用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞B用于基因克隆的載體A用于核酸操作的工具酶看書找答案……1、核酸酶分哪兩種,有什么差別?2、限制性核酸內(nèi)切酶分幾種,哪種最常用,為什么?3、DNA連接酶的作用是什么,哪兩種較常用?4、大腸桿菌DNA聚合酶的種類和作用限制性內(nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割核酸連接酶—用于DNA和RNA的連接核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割A(yù)用于核酸操作的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶一、限制性核酸內(nèi)

2、切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能1968年,Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出HindII和HindIII一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列,并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。切開的是3,5-磷酸二酯鍵。核酸酶分為:外切核酸酶【從一頭開始,順序切斷】內(nèi)切核酸酶【能識別特定序列切斷】內(nèi)切酶生理意義:分解外來DNA,保護(hù)自身DNA二、限制性核酸內(nèi)切酶的類型及其主要特性特性1.限制修飾活性2.內(nèi)切酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3.限制輔助因子4.切割位點5.特異性切割6.基因克隆中I型雙功能的酶3種不同亞基AT

3、P、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特異性位點5‘端至少1000bp不是(隨機)無用II型限制酶和修飾酶分開單一成分Mg2+位于識別位點上是非常有用III型雙功能酶2種亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特異性位點3‘端24-26bp處是用處不大限制性核酸內(nèi)切酶三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名種名株名HindIIIHindIIIHaemophilusinfluenzaed嗜血流感桿菌d株分離順序:同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶四、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素1、DNA樣品的純度:加

4、大酶的用量,1mgDNA用10U酶加大反應(yīng)總體積延長反應(yīng)時間限制性核酸內(nèi)切酶2、DNA樣品的甲基化程度:3、核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì)與II型核酸內(nèi)切酶有關(guān)的幾個概念粘性末端cohesiveends:指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu),它們能夠通過互補堿基間的配對而重新環(huán)化起來。平末端Bluntend:在識別序列對稱處同時切開DNA分子兩條鏈,產(chǎn)生的平齊末端結(jié)構(gòu)。則不易于重新環(huán)化。帶5’-P端的黏性末端帶3’-OH和5’-P端的平末端(一)DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)首個DNA連接酶(li

5、gase)——1967年,大腸桿菌DNA連接酶,是大腸桿菌基因編碼的。1970年,發(fā)現(xiàn)了T4DNA連接酶,由大腸桿菌T4噬菌體基因編碼的。二、DNA連接酶(二)常用的DNA連接酶E.coliDNA連接酶:連接具互補堿基黏性末端(最初研究表明),現(xiàn)在研究可連接平末端;需NAD+輔助因子,活性低,不常用。T4DNA連接酶:連接具互補堿基黏性末端和平末端,需ATP輔助因子,活性高,常用。(三)T4DNA連接酶連接反應(yīng)的條件影響連接效率的因素有:A.溫度(通常在4-15℃)B.ATP的濃度(10μM/L-1?)C.

6、連接酶濃度(平端的連接比粘性末端的連接要困難得多,所需的酶量也多,一般平末端大約需1~2U,黏性末端僅需0.1U)D.反應(yīng)時間(通常連接過夜)E.插入片段和載體片段的摩爾比(1∶1~5∶1)三、DNA聚合酶催化合成DNA的酶特點:不能自行從頭合成DNA鏈,必須有一個RNA引物分類:大腸桿菌DNA聚合酶T4DNA聚合酶T7DNA聚合酶TaqDNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶(一)E.coliDNA聚合酶1.E.coli的DNA聚合酶系統(tǒng)PolI參與DNA修復(fù):具3’→5’和5’→3’外切酶活性polII參與DNA修復(fù):具3

7、’→5’外切酶活性polIII參與DNA復(fù)制:具3’→5’和5’→3’外切酶活性2.E.colipolⅠ的特點1)具兩種外切酶活性和DNA聚合酶活性在蛋白酶作用下,該酶分裂成兩個大小不同的片段,其大片段稱為Klenow片段,具3’→5’外切酶活性2)聚合酶活性,5’→3’,要求3’-OH引物和模板DNA3)外切酶活性(二)T4DNA聚合酶1.特點:5’→3’聚合酶活性;3’→5’外切酶活性【對單鏈DNA強】2.用途:制備高比活性探針(三)TaqDNA聚合酶1.特點:分離自水生棲熱菌,分子量為94,000,最

8、適反應(yīng)溫度75℃,對95℃高溫具良好穩(wěn)定性,該酶不存在3’→5’外切酶活性2.用途主要用于DNA的體外擴(kuò)增,經(jīng)25次循環(huán)后才進(jìn)入酶的反應(yīng)穩(wěn)定期,一個DNA分子因而可被擴(kuò)增4×106倍四、其它DNA修飾酶磷酸酶和T4多聚核苷酸激酶DNA酶Ⅰ(DNaseI)RNA酶(RNase)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TDT)一、DNaseI1.特點:具內(nèi)切酶活性,但無核苷酸序列特異型,產(chǎn)生5’-P低聚核苷酸;Ca2+,Mg2+或Ca

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