工程菌精美生物醫(yī)學

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1、第四節(jié)基因工程菌培養(yǎng)與發(fā)酵什么是基因工程菌?培養(yǎng)和發(fā)酵基因工程菌的目的是什么最常用的基因工程藥物表達系統(tǒng)是什么?基因工程菌的發(fā)酵受到哪些條件的影響?一、概念工程菌是采用現代生物工程技術加工改造,被轉入了外源目的基因的新型微生物具有多功能、高效和適應性強等特點。治理海洋石油泄漏生產基因工程藥物培養(yǎng)和發(fā)酵的目的:外源基因能高水平表達,能獲得大量外源基因產物【其實是指蛋白質的產生,表現出對應的作用】最常用的基因工程藥物表達系統(tǒng)(工程菌體系)大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細胞二、工程菌生長繁殖需要的條件①良好的物理環(huán)

2、境:主要有發(fā)酵溫度、PH值、溶氧量等。②合適的化學環(huán)境:適宜工程菌生長代謝所需的各種營養(yǎng)物質的濃度,并限制各種阻礙生長代謝的有害物質的濃度三、基因工程菌常用的發(fā)酵方法1、批式培養(yǎng)  ???指營養(yǎng)物和工程菌株一次加入進行培養(yǎng),直到培養(yǎng)結束放出,中間除了空氣進入和尾氣排出、酸堿調解PH值外與外部沒有物料交換。傳統(tǒng)的生物制品發(fā)酵多用此過程。2、流加式培養(yǎng)  ???是一種發(fā)酵過程中優(yōu)化化學環(huán)境的一種有效方法,在批式培養(yǎng)基礎上,改善批式培養(yǎng)過程中由于營養(yǎng)物質的消耗造成的重組細胞營養(yǎng)不足,調整了工程菌所處的生長環(huán)境,

3、使工程菌一直處于最佳狀態(tài)工程菌在保存、發(fā)酵過程中不穩(wěn)定,成為制約基因工程轉變?yōu)樯a力的關鍵之一。四、工程菌的穩(wěn)定性外在表現:得不到表達產物、或達不到要求產量。本質:質粒不穩(wěn)定;表達產物不穩(wěn)定。內在表現:質粒丟失;重組質粒DNA片段脫落。1、工程菌不穩(wěn)定性的表現質粒丟失:由環(huán)境因素或生理、遺傳學原因,質粒從宿主中丟失,丟失率因環(huán)境、宿主、質粒結構而有不同。重組質粒上一部分片段脫落:表現為質粒變小或某些遺傳信息發(fā)生變化甚至喪失。表達產物不穩(wěn)定:人干擾素工程菌在表達干擾素時,隨著培養(yǎng)時間的延長,干擾素活性反而下

4、降。影響工程菌穩(wěn)定性的因素:(1)質粒結構:質粒穩(wěn)定區(qū)受到影響,重組質粒上有重復序列等。(2)宿主:宿主中重組基因的完整性、重組時有關基因的變異等。(3)環(huán)境因素:高溫、去垢劑、某些藥物(如利福平)、染料及胸腺嘧啶饑餓、紫外線輻射等都會引起質粒的丟失。(1)組建合適載體構建質粒時,插入一段特殊的DNA片段或基因,使宿主細胞分裂時,質粒能夠較穩(wěn)定地遺傳到子代細胞中。(2)選擇適當宿主在選擇宿主時,須確定其遺傳特點。重組質粒在大腸桿菌中較穩(wěn)定,而在枯草桿菌和酵母中較不穩(wěn)定。2、解決工程菌不穩(wěn)定的對策(3)施加

5、選擇壓力a抗生素添加法通常在重組質粒上含抗藥性基因。轉入不耐藥的宿主后,工程菌獲得了抗藥性。發(fā)酵時,培養(yǎng)基中加入抗生素,可阻止丟失質粒的非生產菌生長。b抗生素依賴變異法誘變使宿主成為某抗生素的依賴性突變株,而重組質粒上含有該抗生素的非依賴性基因。發(fā)酵生產時,不向培養(yǎng)基中加抗生素就能起到消除重組質粒不穩(wěn)定的影響。c、營養(yǎng)缺陷型法誘變使宿主成為營養(yǎng)缺陷型,將相關基因插入到重組質粒中,選擇基礎培養(yǎng)基使失去重組質粒的細胞不能存活,而只有含重組質粒的細胞才能生長。(4)控制基因過量表達外源基因表達水平越高,重組質粒

6、越不穩(wěn)定,如果外源基因的表達受到抑制,則重組質粒不可能丟失。可采取兩階段培養(yǎng)法。(5)控制培養(yǎng)條件眾多環(huán)境因素中,培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)溫度、菌體的比生長速率尤為重要。對一個已經組建完成的克隆菌來說,選擇最合適的培養(yǎng)條件是進行工業(yè)化生產的關鍵步驟。(6)固定化重組菌以提高基因工程菌的穩(wěn)定性。五、基因工程菌生長代謝的特點菌體的生長通常用比生長速率來表示。工程菌培養(yǎng)可通過選用不同的碳源控制補料和稀釋速率等方法來控制菌體的生長。大腸桿菌的蛋白/菌體量的比值是基本恒定的,因而菌體的生長速度反映了蛋白質的合成速度。控制菌

7、體的生長對提高質粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產物積累、提高外源蛋白產率有重要意義。(一)菌體的生長與能量的關系碳源物質是組成培養(yǎng)基的主要成分當菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時,菌體會產生乙酸,導致培養(yǎng)基的pH值下降,從而影響菌體的生長。適當提高pH,可減少乙酸的抑制作用分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源,連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內控制菌體的生長,從而控制乙酸的產生,減少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產生。(二)菌體生長與前體供應的關系在基礎培養(yǎng)基中加入氨基酸(小分子前體)能使菌

8、體比生長率提高,蛋白合成增加。六、基因工程菌發(fā)酵(一)基因工程菌的培養(yǎng)過程⑴通過搖瓶操作基因工程菌生長的基礎條件如溫度、pH、培養(yǎng)基各種組分、碳氧比,分析表達產物的合成、積累對受體細胞的影響;⑵通過培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數和控制方案以及順序。菌種一級種子搖瓶二級種子罐培養(yǎng)擴大培養(yǎng)原料發(fā)酵培養(yǎng)滅菌發(fā)酵生產代謝產物分離基配制微生物工業(yè)發(fā)酵過程簡圖(二)基因工程菌的發(fā)酵工藝基因工程菌的發(fā)酵不僅涉及宿主、載體和克隆基因之間的相互關系還和

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