基因組文庫(kù)的構(gòu)建與應(yīng)用研究進(jìn)展

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1、一.基因組文庫(kù)的構(gòu)建和應(yīng)用研究進(jìn)展隨著后基因組學(xué)時(shí)代來(lái)臨，克隆、研究并利用生物的重要基因、研究它們的結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化己經(jīng)成為遺傳學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。和原核生物相比，真核生物基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，研究起來(lái)較為困難。隨著大片斷DNA克隆技術(shù)的發(fā)展核完善,構(gòu)建真核生物大片斷DNA的基因組文庫(kù)，并以之為平臺(tái)進(jìn)行基因組序列測(cè)定、物理作圖、基因分離、以及基因結(jié)構(gòu)核功能的分析等研究，已經(jīng)成為真核生物基因組研究中行之有效的方法⑴。基因組文庫(kù)是指含有某種牛物全部基因的隨機(jī)片斷的重組DNA克隆群體。這個(gè)文庫(kù)象是一個(gè)貯存有基因組全部序列的信息庫(kù)，故稱為基因

2、組文庫(kù)(genomiclibrary),又稱為人工構(gòu)建的基因“活期儲(chǔ)蓄所”(genomicbank)。人們既可以通過(guò)基因組文庫(kù)的構(gòu)建、貯存和擴(kuò)增特定生物基因組的全部或部分片段，同時(shí)又能夠在必需時(shí)從基因組文庫(kù)中調(diào)出其中的任何DNA片段或目的基因⑵。1基因組文庫(kù)的產(chǎn)生和發(fā)展克隆載體作為基因組文庫(kù)構(gòu)建的重要媒介，提高其容納量一宜是重要發(fā)展方向之一。自1973年Cohen構(gòu)建了第一個(gè)質(zhì)粒載體pSIOl以來(lái)，越來(lái)越多的克隆載體相繼岀現(xiàn)，使得克隆載體的整體結(jié)構(gòu)和克隆效率有了很大改善。載體的發(fā)展大致經(jīng)過(guò)三個(gè)階段:第一代是以入噬菌體和粘粒為代

3、表的載體；第二代的代表為YAC(yeastartificialchromosome)BAC(bacterialartificialchromosome)及PAC(Pl-derivedartificialchromosome)；第三代為BIBAC(binaryBAC)及TAC(transformation-competentartificialchromosome)為代表的新型文庫(kù)載體，不僅具有第二代載體的所有特征，而且具備了植物的轉(zhuǎn)化功能⑶。入噬1.1第一代載體體是最早使用的克隆載體，其插入片斷僅20kb左右⑷。1979年Ro

4、yal等確定了在粘粒(Cosmid)載體中克隆大片斷的可能性⑸。此后粘粒載體用于構(gòu)建果蠅、小鼠、人等基因組文庫(kù)，并從這些文庫(kù)中成功分離得到基因。肺炎支原體基因組全序列的測(cè)定就是粘粒文庫(kù)的基礎(chǔ)上完成的?鐵粘粒是用包含九噬菌體cos位點(diǎn)的質(zhì)粒。載體長(zhǎng)4?6kb,平均插入一般為40kb左右。重組的粘粒可承載外源DNA片段，并象入噬菌體一樣感染大腸桿菌，在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制和增殖。粘粒載體優(yōu)點(diǎn)在于穩(wěn)定性好，嵌合體少。缺點(diǎn)是插入片斷過(guò)小，若用于染色體步行(chromosomewalking)則所需步彳亍次數(shù)太多，很大程度限制了它的應(yīng)用。1?

5、2第二代載體第二階段的克隆載體與第一代載體相比，顯著特點(diǎn)是載體的容載能力擴(kuò)大。酵母人工染色體YAC是最早發(fā)展的真止意義上的人工染色體，具備在寄主細(xì)胞中穩(wěn)定地復(fù)制和遺傳所必須的三個(gè)元件：復(fù)制起始區(qū)(originofreplication),參與染色體DNA復(fù)制起始結(jié)構(gòu)的形成；著絲粒(centromere),負(fù)責(zé)染色體向子細(xì)胞的傳遞；端粒(telomere),對(duì)染色體DNA兩個(gè)末端起封口和保護(hù)作用⑼。酵母人工染色體的平均插入片段可達(dá)到1Mb左右，因此構(gòu)建基因組文庫(kù)時(shí)，只需要較少的克隆數(shù)便可以覆蓋整個(gè)基因組。因此YAC很快成為構(gòu)建復(fù)

6、雜基因組DNA文庫(kù)的主要載體系統(tǒng)。在人類基因組計(jì)劃的早期，YAC文庫(kù)被用于基因組框架的構(gòu)建“叭雖然YAC能容載較大的片段，但同吋也有一些自身難以克服的缺點(diǎn)：一是嵌合現(xiàn)象的存在。即一個(gè)YAC克隆中的插入子可能來(lái)自兩個(gè)或多個(gè)不同的片段,嵌合體的比例達(dá)到40%?60%,這種現(xiàn)象使染色體步行和基因分離難度加大；二是YAC克隆的穩(wěn)定性差，插入片段存在重排(sequencerearrangement)和丟失(insertdeletion)現(xiàn)彖，這對(duì)染色體物理圖譜的構(gòu)建和基因分離都十分不利；三是插入片段的分離和純化困難；四是不能采用電轉(zhuǎn)化，

7、轉(zhuǎn)化效率低。這些缺點(diǎn)限制了YAC的應(yīng)用llu,2JO因此科學(xué)家開(kāi)始把眼光轉(zhuǎn)向?qū)ふ腋玫妮d體系統(tǒng)。1992年BAC載體應(yīng)時(shí)而生口。細(xì)菌人工染色體(BAC)是以大腸桿菌致育因子(F因子)為基礎(chǔ)的合成載體。F因子具有穩(wěn)定遺傳的特點(diǎn)，其復(fù)制是嚴(yán)謹(jǐn)型的，在每個(gè)細(xì)胞屮僅有1?2個(gè)拷貝，減小了插入片段發(fā)生重組的機(jī)率，理論上F因子能夠攜帶1Mb的外源片段,在實(shí)際應(yīng)用中克隆的平均大小約為120kb,個(gè)別BAC重組子中含有的基因組DNA最大可達(dá)300kbo雖然容量沒(méi)有YAC載體大，但BAC載體擁有YAC載體所缺乏而科學(xué)家所需的多個(gè)優(yōu)點(diǎn)：一是以大腸

8、桿菌為寄主，采用電轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)化率高，因此構(gòu)建BAC文庫(kù)比YAC文庫(kù)更容易；二是BAC載體以環(huán)型超螺旋狀態(tài)存在，從大腸桿菌中提取質(zhì)粒較方便，載體中的lacZ元件使人們能夠利用顏色差異區(qū)分重組子，限制性位點(diǎn)能夠用于大片段基因組DNA的克隆。三是BAC的復(fù)制子來(lái)源于F因子，可穩(wěn)定遺傳，