高ACAC通過自噬誘導過量NETs引發(fā)機體免疫抑制的機制研究

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1、分類號．５單位代碼：１０１８３：Ｓ８５６：研究生學號：２０１５８５２０３２密級公開＿吉林大學碩士學位論文學術學位（）高ＡＣＡＣ通過自噬誘導過量ＮＥＴｓ引發(fā)機體免疫抑制的機制研究Ｈ－ｎｄｕｃｅｄｉｇｈａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅｉｎｄｕｃｅｓｅｘｃｅｓｓｉｖｅＮＥＴｓｉａｕｔｏｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙａｕｔｏｈａｐｇｙ作者姓名：崔媛旭專業(yè)：臨床獸醫(yī)學研究方向：獸醫(yī)內(nèi)科學指導教師：劉國文教授培養(yǎng)單位：動物醫(yī)學學院２０１８年６月高ACAC通過自噬誘導過量NETs引發(fā)機體免疫抑制的機制研究Highacetoacet

2、ateinducesexcessiveNETs-inducedautoimmunosuppressionbyautophagy作者姓名：崔媛旭專業(yè)名稱：臨床獸醫(yī)學指導教師：劉國文教授學位類別：農(nóng)學碩士答辯日期：2018年06月04日未經(jīng)本論文作者的書面授權，依法收存和保管本論文書面版本、電子版本的任何單位和個人，均不得對本論文的全部或部分內(nèi)容進行任何形式的復制、、修改、發(fā)行、出租改編等有礙作者著作權的商業(yè)性使用（但純學術性使用不在此限）。否則。，應承擔侵權的法律責任吉林大學博士（或碩士）學位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交學位論文，是本人在指導教師的指導下，

3、獨立進行研究工作所取得的成果。除文中己經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體己經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻的個人和集體，均己在文中以明確方式標明。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔。學位論文作者簽名：日期：名年４月叫日本研究由“國家自然科學基金項目”面上項目（31672621）資助ThisresearchwasfundedbygrantfromtheNaturalScienceFoundationofChina(31672621)中文摘要高ACAC通過自噬誘導過量NETs引發(fā)機體免疫抑制的機制研究圍產(chǎn)期酮病奶牛會引發(fā)高酮血

4、癥，血液中乙酰乙酸(acetoacetate,ACAC)、β-羥丁酸(β-Hydroxybutyrate,BHBA)濃度上升是高酮血癥主要臨床表現(xiàn)之一?；加型〉膰a(chǎn)期奶牛會出現(xiàn)能量負平衡、免疫力低下，同時會引發(fā)乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎等并發(fā)癥。中性粒細胞作為機體的第一道防線發(fā)揮了重要的防御功能，當外源細菌侵入細胞時，中性粒細胞第一時間到達感染處，并通過多種方式進行免疫防御，傳統(tǒng)認為中性粒細胞是通過吞噬病原微生物，形成吞噬泡的抗菌途徑從而對細菌進行清除。近年發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞消滅病原微生物除了傳統(tǒng)上吞噬和脫顆粒兩種方式，在2004年Brinkmann等人發(fā)現(xiàn)一種新的死亡方式，即中性粒細胞胞外誘捕

5、網(wǎng)(neutrophilextracellulartraps,NETs)。NETs是細胞非凋亡性死亡，是機體受到病原刺激后，從中性粒細胞中釋放出來一種網(wǎng)狀結(jié)構，將病原體包裹消滅，其網(wǎng)狀結(jié)構主要成分是DNA。近期又有研究發(fā)現(xiàn)，NETs過量產(chǎn)生，不但不會起到防御作用，可能還會引發(fā)機體產(chǎn)生一些免疫疾病。自噬是生命體中普遍存在的一種自體消化途徑，通過自噬途徑可以維持生命體代謝平衡和保持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。自噬對NETs起到重要作用，抑制自噬會阻斷細胞內(nèi)染色質(zhì)的生長。所以本試驗目的是探究在mTOR通路下高濃度ACAC是否會引發(fā)自噬累積，及誘導NETs過量形成，同時自噬是否影響ACAC誘導NETs的生成

6、量。本試驗首先通過模擬酮病病理濃度，檢測在體外培養(yǎng)的中性粒細胞中，添加不同濃度ACAC(0mM,0.25mM,0.5mM,1mM,2mM)和高濃度ACAC(2mM)的不同時間(0h,1h,2h,4h,8h,12h)是否會引發(fā)中性粒細胞自噬累積。通過免疫熒光對自噬蛋白熒光強度進行定性分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)高濃度ACAC誘導后LC3蛋白熒光強度明顯高于空白對照組。同時又采用蛋白免疫印跡方法對LC3Ⅱ蛋白進行定量分析，結(jié)果和免疫熒光結(jié)果一致，高濃度的ACAC可以引發(fā)自噬累積。I其次，對高濃度ACAC作用下NETs形成情況進行研究。通過激光共聚焦顯微鏡可以清楚看到ACAC誘導中性粒細胞向胞外釋放的DNA網(wǎng)

7、狀結(jié)構。同時采用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、佛波酯(phorbolester,PMA)作為實驗的陽性對照。另外，還采用了蛋白免疫印跡、ELISA等實驗方法對NETs上其他主要成分進行檢測，結(jié)果顯示，高濃度的ACAC可以誘導生成過量NETs。最后，對自噬是否影響高濃度ACAC誘導NETs形成的機制進行研究，分別添加自噬抑制劑3-MA,LY294002和mTOR通路激動劑MHY1485，通過蛋白免疫印跡、免疫