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《高效液相色譜詳解-郝建濤》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、高效液相色譜 （HPLC）主講：郝鳳霞能源化工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目錄基礎(chǔ)理論上機(jī)操作前的準(zhǔn)備工作Agillent1100的操作常見(jiàn)故障排除HPLC在科研中的應(yīng)用一、基礎(chǔ)理論溶于流動(dòng)相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，由于與固定相(stationaryphase)發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。1、色譜柱的分離原理色譜分析法的分類(lèi)按兩相的狀態(tài)分類(lèi)流動(dòng)相液體流動(dòng)相氣體固定相固體液體固定相固體液體名稱(chēng)液固色譜液液色譜名稱(chēng)氣固色譜氣液色譜總稱(chēng)液相色譜總稱(chēng)氣相色譜
2、2、分離模式——鍵合相色譜、液液色譜、尺寸排阻色譜鍵合相色譜正相色譜：流動(dòng)相極性<固定相極性分離在水中絕對(duì)不溶解的物質(zhì)或同分異構(gòu)體反相色譜：流動(dòng)相極性>固定相極性常規(guī)分析，80％色譜圖和峰參數(shù)色譜圖(chromatogram)--樣品流經(jīng)色譜柱和檢測(cè)器，所得到的信號(hào)-時(shí)間曲線，又稱(chēng)色譜流出曲線?；€(baseline)--經(jīng)流動(dòng)相沖洗，柱與流動(dòng)相達(dá)到平衡后，檢測(cè)器測(cè)出一段時(shí)間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時(shí)間軸。噪音(noise)--基線信號(hào)的波動(dòng)。通常因電源接觸不良或瞬時(shí)過(guò)載、檢測(cè)器不穩(wěn)定、流動(dòng)相含有氣泡或色譜柱被污染所致。漂移(drift)
3、--基線隨時(shí)間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動(dòng)相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來(lái)也會(huì)產(chǎn)生漂移。3、HPLC中的基本概念和術(shù)語(yǔ)色譜峰(peak)--組分流經(jīng)檢測(cè)器時(shí)響應(yīng)的連續(xù)信號(hào)產(chǎn)生的曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對(duì)稱(chēng)形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）。峰高(peakheight，h)-峰的最高點(diǎn)至峰底的距離。峰寬（peakwidth，W)-峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線與基線的兩個(gè)交點(diǎn)間的距離。半峰寬（peakwidthathalf-height，Wh/2)-峰高一半處的峰寬。峰面積(peakarea
4、，A)-峰與峰底所包圍的面積。死時(shí)間(deadtime，t0)--不保留組分的保留時(shí)間。即流動(dòng)相（溶劑）通過(guò)色譜柱的時(shí)間。保留時(shí)間(retentiontime，tR)--從進(jìn)樣開(kāi)始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時(shí)間。流動(dòng)相的洗脫方式等度洗脫輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器單一或混合溶劑梯度洗脫A泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器B泵AB時(shí)間B濃度分析時(shí)間長(zhǎng)分離度差MeOH/H2O=4/6MeOH/H2O=8/2等度洗脫95%30%MeOH濃度梯度洗脫梯度洗脫是HPLC的常用手段梯度洗脫裝置流動(dòng)相中含有兩種或兩種以上不同極性的溶劑，在洗脫過(guò)程中連續(xù)
5、或間斷的改變流動(dòng)相的組成，以調(diào)節(jié)它的極性，使樣品中每個(gè)組分都有較高的分離度，從而實(shí)現(xiàn)各組分的圓滿(mǎn)分離，梯度洗脫可提高柱效，縮短分析時(shí)間，改善檢測(cè)器的靈敏度，它類(lèi)似于氣相色譜的程序升溫技術(shù)。4、高效液相色譜法的應(yīng)用范圍高效液相色譜法適于分析沸點(diǎn)高、相對(duì)分子質(zhì)量大，受熱易分解的不穩(wěn)定有機(jī)化合物、生物活性物質(zhì)以及多種天然產(chǎn)物，這些化合物約占全部有機(jī)化合物的80%，可應(yīng)用于化工生產(chǎn)、制藥工業(yè)、食品工業(yè)、生物化工、醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。5、HPLC的系統(tǒng)輸液泵相當(dāng)于人的心臟，不斷提供連續(xù)、穩(wěn)定、精確的流量進(jìn)樣器樣品引入系統(tǒng)色譜柱關(guān)鍵部分，在
6、這里樣品實(shí)現(xiàn)分離檢測(cè)器對(duì)分離后的樣品進(jìn)行檢測(cè)數(shù)據(jù)記錄與處理裝置數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)HPLC的系統(tǒng)組成Agilent1100高效液相色譜儀儲(chǔ)液瓶真空脫氣機(jī)混合室自動(dòng)進(jìn)樣器分離柱VWD手動(dòng)進(jìn)樣自動(dòng)進(jìn)樣六通閥進(jìn)樣演示分離系統(tǒng)－色譜柱功能：組分分離目標(biāo)：分辨力強(qiáng)效率高吸附劑－－－化學(xué)鍵和固定相色譜柱化學(xué)鍵合相色譜柱:70%將不同的官能團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵和到硅膠表面的游離羥基上，而形成化學(xué)鍵和固定相，進(jìn)而形成化學(xué)鍵和相色譜柱。反相:C18,65%;C8,15%;反相色譜是目前應(yīng)用得最為廣泛的高效液相色譜方法。正相:
7、20%;-NH2、-CN其它(手性柱，離子交換柱):10%柱溫箱控制溫度，保證分析結(jié)果重現(xiàn)性升高溫度，降低了流動(dòng)相的黏度，降低柱壓，保證色譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性升溫對(duì)于反相HPLC分離強(qiáng)疏水肽的影響(B27)流動(dòng)相:A:含0.05%三氟乙酸的水B:含0.05%三氟乙酸的乙腈2%B/min進(jìn)樣量:100μL(50μg的6M脲/5%乙酸)UV:210nm流速:1mL/min室溫液相色譜柱:C18色譜柱尺寸:4.6x250mm5μm室溫300C400C500C600C700C提高柱溫，可增加柱效（提高靈敏度）檢測(cè)器選擇性紫外(VWD、DAD)熒光電化學(xué)
8、通用型示差折光蒸發(fā)光散射質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)藥典中的液相檢測(cè)器檢測(cè)器簡(jiǎn)介（一）◆紫外吸收檢測(cè)器（UVD）原理：用特定波長(zhǎng)的紫外光照射樣品池，通過(guò)檢測(cè)透光率的變化來(lái)測(cè)定樣品濃度的檢測(cè)器。它具有波長(zhǎng)固定，
