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《高效液相色譜（hplchighperformanceliquid》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在應用文檔-天天文庫。
1、高效液相檢測技術培訓講義高效液相色譜（HPLC：HighPerformanceLiquidChromatography）是化學、生物化學與分子生物學、醫(yī)藥學、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、商檢、藥檢、法檢等學科領域與專業(yè)最為重要的分離分析技術，是分析化學家、生物化學家等用以解決他們面臨的各種實際分離分析課題必不可缺少的工具。國際市場調查表明，高效液相色譜儀在分析儀器銷售市場中占有最大的份額，增長速度最快。高效液相色譜的優(yōu)點是：檢測的分辨率和靈敏度高，分析速度快，重復性好，定量精度高，應用范圍廣。適用于分析高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差的化合物。其缺點是：價格昂貴，要用各種填料柱，容量小，分析
2、生物大分子和無機離子困難，流動相消耗大且有毒性的居多。目前的發(fā)展趨勢是向生物化學和藥物分析及制備型傾斜。一、基本原理加樣流動相固定相流動相AABCBCBA固定相——柱內(nèi)填料，流動相——洗脫劑。HPLC是利用樣品中的溶質在固定相和流動相之間分配系數(shù)的不同，進行連續(xù)的無數(shù)次的交換和分配而達到分離的過程。通常，按溶質（樣品）在兩相分離過程的物理化學性質可以作如下的分類：分配色譜：——分配系數(shù)親和色譜：——親和力吸附色譜：——吸附力離子交換色譜：——離子交換能力凝膠色譜（體積排阻色譜）：——分子大小而引起的體積排阻分配色譜又可分為：正相色譜：固定相為極性，流動相為非極性。高效液相檢測技
3、術培訓講義反相色譜：固定相為非極性，流動相為極性。用的最多，約占60～70％。固定相（柱填料）：固定相又分為兩類，一類是使用最多的微粒硅膠，另一類是使用較少的高分子微球。后者的優(yōu)點是強度大、化學惰性，使用pH范圍大，pH=1～14，缺點是柱效較小，常用于離子交換色譜和凝膠色譜。最常使用的全孔微粒硅膠（3～10μm）是化學鍵合相硅膠，這種固定相要占所有柱填料的80％。它是通過化學反應把某種適當?shù)幕瘜W官能團（例如各種有機硅烷），鍵合到硅膠表面上，取代了羥基（－OH）而成。它是近代高效液相色譜技術中最重要的柱填料類型。使用微粒硅膠要特別注意它的使用pH范圍是2～7.5，若過堿（＞pH
4、7.5），硅膠會粉碎或溶解；若過酸（＜pH2），鍵合相的化學鍵會斷裂。鍵合相使用硅膠作基質的優(yōu)點是：①硅膠的強度大；②微粒硅膠的了孔結構和表面積易人為控制。③化學穩(wěn)定性好。最常用的“萬能柱”填料為“C18”，簡稱“ODS”柱，即十八烷基硅烷鍵合硅膠填料（Octadecylsilyl，簡稱ODS）。這種填料在反相色譜中發(fā)揮著極為重要的作用，它可完成高效液相色譜70～80％的分析任務。由于C18(ODS)是長鏈烷基鍵合相，有較高的碳含量和更好的疏水性，對各種類型的生物大分子有更強的適應能力，因此在生物化學分析工作中應用的最為廣泛，近年來，為適應氨基酸、小肽等生物分子的分析任務，又發(fā)
5、展了CH、C3、C4等短鏈烷基鍵合相和大孔硅膠（20～40μm）。按鍵合到基質上的官能團可分為：⑴反相柱：填料是非極性的，官能團為烷烴，例如：C18(ODS)、C8、C4等。⑵正相柱：填料是極性的，官能團為－CN氰基、－NH2氨基等。⑶離子交換鍵合相：陽離子官能團：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。陰離子官能團：―R4N＋季銨基、-氨基等。(由于硅膠基質的鍵合相只能在pH＝2～7.5的范圍內(nèi)使用，而離子交換色譜要求有更寬的pH范圍，因此其基質現(xiàn)在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯。)流動相：高效液相檢測技術培訓講義反相色譜最常用的流動相及其沖洗強度如下：H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙
6、醇＜異丙醇＜四氫呋喃最常用的流動相組成是：“甲醇—H2O”和“乙腈—H2O”，由于乙腈的劇毒性，通常優(yōu)先考慮“甲醇—H2O”流動相。反相色譜中，溶質按其疏水性大小進行分離，極性越大疏水性越小的溶質，越不易與非極性的固定相結合，所以先被洗脫下來。流動相的pH對樣品溶質的電離狀態(tài)影響很大，進而影響其疏水性，所以在分離肽類和蛋白質等生物大分子的過程中，經(jīng)常要加入修飾性的離子對物質，最常用的離子對試劑是三氟乙酸（TFA），使用濃度為0.1％，使流動相的pH值為2～3，這樣可以有效地抑制氨基酸上α羧基的離解，使其疏水性增加，延長洗脫時間，提高分辨率和分離效果。完全離子化的溶質，例如強酸或
7、強堿，其在反相鍵合相上的保留值很低，近于死時間流出，不能進行分析。根據(jù)離子對色譜的原理將一種與樣品離子電荷（A＋）相反的離子（B－），稱為對離子，加入到流動相中，使其與樣品離子結合生成弱極性的離子對，即中性締合物，從而增強了樣品的疏水性，加大了保留值，改善了分離效果。正相色譜常用的流動相及其沖洗強度的順序是：正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜異丙醇其中最常用的是正已烷，雖然其價格較貴，但80％的順、反和鄰位、對位異構體仍然要用正相色譜來進行分離。流動相的選擇原則是：①樣品易溶，且溶解度盡可能大。②化學
