組織因子在人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中表達(dá)及調(diào)控的研究

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1、萬方數(shù)據(jù)中圖分類號UDCR孓r(nóng)610博士學(xué)位論文學(xué)校代碼10553組織因子在人胚胎千細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中表達(dá)及調(diào)控的研究TheexpressionandregulationofTissueFactor(TF)duringhumanemblVOnicstemceUdif氨erentiationdUrlngnUmanemDlyOnlCStemCe兒nlIIerenIlaⅡ0n作者姓名：俞妍慧學(xué)科專業(yè)：臨床醫(yī)學(xué)研究方向：血栓與止血學(xué)院(系、所)：湘雅醫(yī)院指導(dǎo)教師：陳方平教授論文答辯日期壟!!：!!：蘭；答辯委員會主席蘭生!叢中南

2、大學(xué)二0一三年十一月萬方數(shù)據(jù)原創(chuàng)性聲明本人聲明，所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了論文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中南大學(xué)或其他單位的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我共同工作的同志對本研究所作的貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明。作者簽名：么社曰期：盟年衛(wèi)月與日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人了解中南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留學(xué)位論文并根據(jù)國家或湖南省有關(guān)部門規(guī)定送交學(xué)位論文，允許學(xué)位論文被查閱和借閱；

3、學(xué)校可以公布學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容，可以采用復(fù)印、縮印或其它手段保存學(xué)位論文。同時授權(quán)中國科學(xué)技術(shù)信息研究所將本學(xué)位論文收錄到《中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》，并通過網(wǎng)絡(luò)向社會公眾提供信息服務(wù)。作者簽名：罅導(dǎo)師簽名鷴魄迎年衛(wèi)月與日萬方數(shù)據(jù)本課題基金資助>國家自然科學(xué)基金(項目批準(zhǔn)號：81170477)>中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(項目批準(zhǔn)號：2011QNzTl51)>教育部博士點基金(項目批準(zhǔn)號：201101621200lo)萬方數(shù)據(jù)博士學(xué)位論文中文摘要組織因子在人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中表達(dá)及調(diào)控的研究摘要在機(jī)體的發(fā)育過程中，

4、基因的表達(dá)受到精確的調(diào)控。這種調(diào)控使基因按照機(jī)體發(fā)育的需要，表達(dá)呈現(xiàn)出特異的時間和空間特異性。近年來基因與蛋白的特異性表達(dá)已經(jīng)成為發(fā)育生物學(xué)中的研究熱點。組織因子(Tissuef．a(chǎn)ctor’TF)，又稱為凝血因子III、CDl42，是由263個氨基酸殘基組成的跨膜單鏈糖蛋白，在體內(nèi)廣泛表達(dá)，其在許多重要的生理及病理情況下，特別是維持機(jī)體凝血平衡和保護(hù)重要臟器方面具有重要作用。血栓與止血平衡是發(fā)育過程中最重要的穩(wěn)態(tài)之一。在血細(xì)胞形成之前，由滋養(yǎng)層細(xì)胞(Trophoblast)表達(dá)的大量TF使胚胎穩(wěn)定，在防止流產(chǎn)和妊娠大出

5、血方面有重要意義。在血細(xì)胞形成后，TF在不同的血細(xì)胞中表達(dá)水平不同，其具體調(diào)控機(jī)制目前尚未明確。人胚胎干細(xì)胞(hlIllanemb巧onicstemcells，11ESCs)由于其維持自我干細(xì)胞特性及多向分化潛能的特性，成為我們研究基因時間和空間特異性表達(dá)的良好模型。miRNA是一類約17．24個堿基的非編碼單鏈小分子IⅢA?，F(xiàn)在已知miRNAs這些微小的砌叮As控制著許多重要的生理或病理過程。而Akt和Erkl／2在包括發(fā)育、細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中起重要作用。在本實驗中我們以人類胚胎干細(xì)胞為體外模型，分化成造血

6、細(xì)胞及滋養(yǎng)層細(xì)胞，檢測不同分化階段細(xì)胞中TF的表達(dá)水平的變化。并lIl萬方數(shù)據(jù)博士學(xué)位論文中文摘要進(jìn)一步探討在分化過程中，miI州A及Erkl／2對TF表達(dá)的調(diào)控。本研究分為以下三個部分：第一部分組織因子在人胚胎干細(xì)胞分化過程中的表達(dá)變化目的建立有效的人胚胎干細(xì)胞向造血細(xì)胞及滋養(yǎng)層細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系，為后續(xù)實驗提供可靠地細(xì)胞標(biāo)本。檢測分化過程中不同階段TF的表達(dá)水平。方法①將人胚胎干細(xì)胞(艟SCs)誘導(dǎo)分化出造血干／祖細(xì)胞(hematopoieticstem／progenitorcells，HSPCs)及滋養(yǎng)層細(xì)胞；②將造

7、血干／祖細(xì)胞分化為粒．單細(xì)胞及紅細(xì)胞；③流式細(xì)胞學(xué)檢測造血細(xì)胞特異性標(biāo)記，肌PCR檢測滋養(yǎng)層細(xì)胞特異性標(biāo)記；④磁珠分選CD34+，或CDl4+，或CDl5+細(xì)胞，檢測TF(CDl42)表達(dá)水平；⑤qPCR，R1乙PCR及WeStemblot檢測TF的mRNA及蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果①人胚胎干細(xì)胞(11ESCs)與小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(0P9)共培養(yǎng)第8天，流式細(xì)胞學(xué)檢測CD34+細(xì)胞比例達(dá)到17．2％，磁珠分選后，流式細(xì)胞學(xué)檢測TF表達(dá)為陰性；②添加不同細(xì)胞因子組合誘導(dǎo)粒．單細(xì)胞及紅細(xì)胞，磁珠分選后檢測TF表達(dá)，發(fā)現(xiàn)粒．單細(xì)胞

8、TF表達(dá)呈陽性，紅細(xì)胞TF表達(dá)呈陰性；③RT-PCR檢測BMP4方法誘導(dǎo)分化第0天、第2天、第5天的滋養(yǎng)層細(xì)胞，培養(yǎng)第0天可見OCT-4、Nanog表達(dá)；培養(yǎng)第5天可見滋養(yǎng)層特異性基因CDx2表達(dá)，TF表達(dá)：④粒．單細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞TF的m砌蛆和蛋白水平有表達(dá)，而人胚胎干細(xì)胞、造血干／祖細(xì)胞、紅細(xì)胞TF不表達(dá)。結(jié)論我