曲牙土天牛高毒力綠僵菌菌株篩選

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1、曲牙土天牛高毒力綠僵菌菌株篩選［摘要］目的：明確昆蟲(chóng)病原真菌綠僵菌對(duì)化橘紅害蟲(chóng)曲牙土天牛幼蟲(chóng)的毒力，篩選高致病力菌株，為曲牙土天牛的生物防治提供依據(jù)。方法：先利用從化橘紅基地土壤中分離及其他實(shí)驗(yàn)室提供的36株綠僵菌，制成胞子濃度為1X108個(gè)/g的胞子土，對(duì)曲牙土天牛1齡幼蟲(chóng)進(jìn)行初步的毒力測(cè)定；在此基礎(chǔ)上選取7株分離自化橘紅基地土壤的綠僵菌作進(jìn)一步篩選；并通過(guò)液固雙相發(fā)酵法對(duì)篩選出的高毒力菌株的產(chǎn)胞能力進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。結(jié)果：用于作初步毒力測(cè)定的36株綠僵菌中，有28株能夠侵染曲牙土天牛幼蟲(chóng)，其中6株僵蟲(chóng)率達(dá)100%,8株達(dá)80%,8株達(dá)60%,2株達(dá)40%,4株達(dá)20%；用于作進(jìn)一步毒力篩選的

2、7株菌中，有6株表現(xiàn)出較高的毒力，最高僵蟲(chóng)率均大于74%；對(duì)這6株菌的產(chǎn)胞量進(jìn)行測(cè)定，產(chǎn)胞量均大于10億個(gè)/g,其中1,4株菌產(chǎn)胞量顯著高于其他菌株，分別為2.35±0,25（1X109個(gè)胞子/g），2.21±0.27（1X109個(gè)胞子/g）。結(jié)論：1號(hào)和4號(hào)菌株對(duì)曲牙土天牛1齡幼蟲(chóng)表現(xiàn)出了較高的毒力，并有最強(qiáng)的產(chǎn)胞能力，因此最具開(kāi)發(fā)潛力。［關(guān)鍵詞］化橘紅；曲牙土天牛；綠僵菌；毒力測(cè)定蟲(chóng)害防治是目前中藥材生產(chǎn)中最薄弱的環(huán)節(jié)之一，是實(shí)施中藥材GAP的重點(diǎn)和難點(diǎn)，在綠色中藥材的生產(chǎn)中要防止農(nóng)藥對(duì)藥材的污染，由于目前市場(chǎng)上缺乏有效的、可替代傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥的新型殺蟲(chóng)劑，使得綠色藥材生產(chǎn)理念難以貫徹實(shí)施

3、，因此開(kāi)發(fā)有效的生物殺蟲(chóng)劑成為亟待解決的問(wèn)題。綠僵菌Metarhizium是一類通過(guò)昆蟲(chóng)體表進(jìn)行侵染的蟲(chóng)生病原真菌，能夠侵染200多種昆蟲(chóng)以及硬脾等其他節(jié)肢動(dòng)物[1],目前已經(jīng)大規(guī)模成功應(yīng)用于防治非洲以及澳大利亞的蝗蟲(chóng)[2],是一類具有很大開(kāi)發(fā)價(jià)值的生物殺蟲(chóng)劑。化橘紅為蕓香科植物化州柚Citrusgrandis'Tomentosa'或柚C.grandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外層果皮，具有鎮(zhèn)咳祛痰的功效，是我國(guó)的傳統(tǒng)道地藥材[3]。近年來(lái)化橘紅根部受到一種地下害蟲(chóng)曲牙土天牛Dorystheneshydropiucspascoes的嚴(yán)重危害，給化橘紅生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失[4],

4、由于曲牙土天牛幼蟲(chóng)生活在地下，防治難度大，常規(guī)的化學(xué)農(nóng)藥很難奏效。作者先前在基地調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，土天牛幼蟲(chóng)有被蟲(chóng)生菌感染的現(xiàn)象，并已從化橘紅基地土壤中分離到一批綠僵菌[5],據(jù)此，本研究選擇36株綠僵菌對(duì)化橘紅害蟲(chóng)曲牙土天牛1齡幼蟲(chóng)進(jìn)行毒力測(cè)定，以期篩選出對(duì)其具有高毒力的菌株，為利用綠僵菌防治曲牙土天牛奠定基礎(chǔ)。1材料1.1綠僵菌菌株共計(jì)36株，其中17株由本實(shí)驗(yàn)室分離自廣東化州化橘紅基地土壤中，2株來(lái)自重慶市中藥研究院，9株來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所農(nóng)業(yè)部生物防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，8株來(lái)自安徽省微生物防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，其中菌株mf05為黃綠綠僵菌Metarhiziumflavoviride,mt

5、05為戴氏綠僵菌M.tail,其余菌株均為金龜子綠僵菌M.anisopliae01.2SDY液體培養(yǎng)基1L培養(yǎng)液含酵母浸膏10g,蛋白月東10g,葡萄糖40go1.3大米培養(yǎng)基200g大米裝入體積8cmX9cmX34cm、一端開(kāi)口的聚丙烯食用菌菌種袋里，加60mL水，混勻，靜置0.5h使大米充分吸水后，擰攏袋口，120匸高壓蒸汽滅菌0.5ho1.4曲牙土天牛幼蟲(chóng)2011年5月底6月初，在廣東化州市平定鎮(zhèn)天堂嶂的藥材基地，夜間利用燈光誘捕曲牙土天牛成蟲(chóng)，配對(duì)繁殖飼養(yǎng)獲得。1.5儀器北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司D-1型自動(dòng)蒸汽滅菌鍋；太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠TH2-D臺(tái)式恒溫振蕩器；湖北黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司

6、MJ-01型霉菌培養(yǎng)箱；LeicaDM2000顯微鏡與LeicaDFC425C顯微數(shù)碼相機(jī)組合的成像系統(tǒng)。2方法2.1綠僵菌分生胞子制備向長(zhǎng)滿綠僵菌胞子的試管斜面中注入2mL0.5%的滅菌聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯（吐溫-80）溶液，利用接種鉤刮動(dòng)胞子塊使其從培養(yǎng)基上脫離并分散開(kāi)，搖動(dòng)斜面使胞子充分懸浮。將砲子懸浮液倒入含40mLSDY培養(yǎng)液的三角瓶中，25°C,140r?minl,搖瓶培養(yǎng)72h。將培養(yǎng)好的菌液倒入含有大米培養(yǎng)基的菌種袋里，拌勻使菌液均勻分布到大米基質(zhì)中，將菌種袋平放，撐開(kāi)袋體，使大米培養(yǎng)基能充分與空氣接觸，擰攏菌種袋口避免外界雜菌進(jìn)入，同時(shí)留一定縫隙以供氣體交換，將菌種袋

7、置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中、自然光照培養(yǎng)約2周，當(dāng)綠僵菌開(kāi)始大量產(chǎn)砲時(shí)，完全打開(kāi)發(fā)酵袋口以便袋內(nèi)水分排出，繼續(xù)培養(yǎng)一周完成發(fā)酵。利用胞子收集器從發(fā)酵物料里面收集純胞粉，純胞粉在變色硅膠干燥器中室溫干燥1周，4°C保存?zhèn)溆?。稱量一定質(zhì)量的砲子粉用0.5%吐溫-80水溶液懸浮，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)、計(jì)算出每克純胞粉的胞子含量。2.2高毒力菌株的初步篩選綠僵菌胞子粉在進(jìn)行毒力測(cè)定前先進(jìn)行胞子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，保證用于測(cè)試的胞子