YB_10248_王連榮_ZY

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1、論文中英文摘要作者姓名：王連榮論文題目：dnd基因簇對(duì)細(xì)菌DNA骨架的磷硫?；蛐揎椬髡吆?jiǎn)介：王連榮，女，1980年03月出生，2003年09月師從于上海交通大學(xué)鄧子新教授，于2008年3月獲博士學(xué)位。中文摘要本研究致力于探索DNA硫修飾的發(fā)生方式，解析這種“前所未見(jiàn)”的生理修飾的精細(xì)化學(xué)結(jié)構(gòu)，也為后續(xù)DNA硫修飾的生物途徑、生物學(xué)意義等研究提供方向性指導(dǎo)。本學(xué)位論文成功地揭示了細(xì)菌中dnd基因簇可以將硫原子整合到DNA的磷酸骨架上,形成序列特異性、空間構(gòu)象專一性的磷硫酰化修飾，揭示這種特異的生理修飾存在于不同的細(xì)菌中,并導(dǎo)致了電泳過(guò)程中的DNA降解表型。DNA降解表型(D

2、NAdegradation，Dnd)最初是從變鉛青鏈霉菌中觀察到的：電泳過(guò)程中，變鉛青鏈霉菌的染色體不再是清晰的DNA條帶，而是呈現(xiàn)降解狀態(tài)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這是由于DNA上發(fā)生了一種異常的復(fù)制后修飾，導(dǎo)致DNA在電泳過(guò)程中容易遭受陽(yáng)極產(chǎn)生的Tris過(guò)酸衍生物位點(diǎn)特異性攻擊而產(chǎn)生雙鏈切割反應(yīng)。最近，研究者發(fā)現(xiàn)，這種異常修飾實(shí)際上是與dnd基因簇相關(guān)的DNA硫修飾。通過(guò)放射性35S喂養(yǎng)，在具有dnd同源基因簇/Dnd表型的變鉛青鏈霉菌66，阿維鏈霉菌NRRL8165和熒光假單胞菌Pf0-1的DNA上檢測(cè)到放射性硫信號(hào)，揭示出除了碳、氫、氧、氮和磷，DNA上還存在第六種元素——

3、硫。本研究首先通過(guò)35S半胱氨酸喂養(yǎng)具有dnd同源基因簇/Dnd表型的基因工程大腸桿菌，并分離到放射性硫標(biāo)記的基因組DNA。隨后，把基因組DNA酶解、去磷酸化成單脫氧核糖核苷，并利用高壓液相色譜分離，結(jié)合液體閃爍計(jì)數(shù)器對(duì)每分鐘分離組分的放射性強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)硫修飾DNA分子的保留時(shí)間進(jìn)行了精確定位，由此展開(kāi)了對(duì)這種“前所未見(jiàn)”的硫修飾DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)的探索?；诹蛐揎桪NA分子在高壓液相色譜中的“位置”，繼而采用高壓液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)其組分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了一組可能來(lái)自硫修飾DNA分子特征性質(zhì)譜信號(hào)597，446，348，152和136。其中，152是特征性的帶有一個(gè)

4、正電荷的鳥(niǎo)嘌呤堿基(G)的核質(zhì)比；136則是特征性的帶有一個(gè)正電荷的腺嘌呤堿基(A)的核質(zhì)比。提示我們?cè)诮?jīng)過(guò)核酸酶的酶切后，可能的硫修飾分子仍然同時(shí)包含腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤。結(jié)合這組核質(zhì)比信號(hào)以及該分子對(duì)核酸酶具有抗性的特征，提出DNA分子的硫修飾可能發(fā)生在DNA骨架上，磷酸二酯鍵發(fā)生磷硫?；蔀榱虼姿岫ユI，并存在于脫氧鳥(niǎo)苷和脫氧腺苷之間，即5'-d(GPSA)-3'或者5'-d(APSG)-3'，暗示DNA硫修飾不像人們最初預(yù)料的那樣發(fā)生在相對(duì)活躍的DNA堿基上。對(duì)基因工程大腸桿菌中硫修飾DNA分子和合成標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了高壓液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、高精度質(zhì)譜、紫外特征吸收色譜以及四

5、級(jí)質(zhì)譜斷裂模式對(duì)比分析，最終揭示出DNA硫修飾的化學(xué)本質(zhì)，證實(shí)基因工程大腸桿菌中硫修飾DNA分子的確以硫代磷酸二酯鍵的方式、按5'-3'的方向序列特異性發(fā)生在脫氧鳥(niǎo)苷和脫氧腺苷之間——5'-d(GPSA)-3'。進(jìn)一步利用對(duì)底物具有空間構(gòu)象選擇性的核酸酶對(duì)大腸桿菌中硫修飾DNA分子5'-d(GPSA)-3'進(jìn)行水解；結(jié)合其在高壓液相色譜中的保留時(shí)間提出DNA硫修飾不但具有序列選擇性，還具有空間構(gòu)象專一性，特異性地以RP構(gòu)象存在。在Dnd表型的發(fā)現(xiàn)菌變鉛青鏈霉菌中，利用放射性硫標(biāo)記、高壓液相色譜-質(zhì)譜、紫外特征吸收色譜以及高精度質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)DNA硫修飾在不同菌屬中具有不同的

6、序列選擇性。不同于大腸桿菌中的5'-d(GPSA)-3'RP，鏈霉菌的DNA硫修飾同樣以硫代磷酸二酯鍵形式、RP空間構(gòu)象存在，但序列特異性不同，發(fā)生在兩個(gè)脫氧鳥(niǎo)苷之間——5'-d(GPSG)-3'。目前已經(jīng)在100多種微生物中觀察到Dnd表型，并在許多廣泛分布的細(xì)菌中檢測(cè)到dnd同源基因簇的存在。通過(guò)對(duì)來(lái)自截然不同棲息地的厭氧菌GeobacteruraniumreducensRf4、遍在遠(yuǎn)洋桿菌CandidatusPelagibacterubiqueHTCC1002、熒光假單胞菌PseudomonasfluorescensPf0-1、希瓦氏菌Shewanellapealea

7、naATCC700345、海洋細(xì)菌HahellachejuensisKCTC2396，以及海洋桿菌Oceanobactersp.RED65進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌的基因組中都具有dnd同源基因簇，包含5個(gè)或4個(gè)dnd同源基因。結(jié)合高壓液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，逐一鑒定出這些細(xì)菌都發(fā)生了DNA硫修飾，都以5'-d(GPSA)-3'RP或者5'-d(GPSG)-3'RP的方式在DNA骨架上發(fā)生磷硫?；?。說(shuō)明DNA硫修飾不是偶然發(fā)生的生命現(xiàn)象，是廣泛存在的具有序列選擇性、空間構(gòu)象專一性的新型修飾系統(tǒng)。體外化學(xué)合成的硫代磷酸