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《實驗二 細菌的革蘭氏染色與芽孢染色》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、實驗二細菌的革蘭氏染色與芽孢染色一、目的要求1.學習微生物涂片、染色的基本技術，學習并初步掌握細菌的革蘭氏染色法。2.了解革蘭氏染色法的原理及其在細菌分類鑒定中的重要性。二、實驗材料1.菌種：金黃色葡萄球菌（StapHylococcusaureus）大腸桿菌（E.coli）2.試劑：草酸銨結晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番紅液3.其他：顯微鏡、載玻片、接種環(huán)、酒精燈、無菌水、香柏油、二甲苯等。三、實驗原理革蘭氏染色法是細菌學中最重要的鑒別染色法。是1884年由丹麥病理學家ChristainGram創(chuàng)立的。通過革蘭氏染色可把細菌
2、區(qū)分為兩大類。革蘭氏染色的基本步驟：先用結晶紫初染、次經碘液媒染、再用95%乙醇脫色、最后用蕃紅復染。經過此法染色后，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；如果細胞染上復染的紅色的細菌為革蘭氏陰性菌。大腸桿菌是標準的革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌是標準的革蘭氏陽性菌。革蘭氏染色的機理，與細菌細胞壁的化學組成和結構有關。經結晶紫初染以后，所有的細菌都被染成藍紫色。碘作為媒染劑，它能與結晶紫結合形成復合物，從而增強了染料與細菌的結合力。當用乙醇脫色時，兩類細菌的脫色效果是不同的，革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網狀結構組
3、成、壁厚、類脂含量低，用乙醇脫色處理時細胞壁脫水、使肽聚糖層的網狀結構孔徑縮小，透性降低，從而使結晶紫-碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內；革蘭氏陰性細菌的細胞壁中肽聚糖層在內層且較薄、類脂含量高，所以當脫色處理時，類脂被乙醇溶解、細胞壁透性增加，使結晶紫-碘的復合物被洗脫出來。用蕃紅復染時染上紅色。四、操作步驟基本流程：涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脫色→復染）→鏡檢。1.制片：取菌種培養(yǎng)物常規(guī)涂片、干燥、固定。常規(guī)涂片法：取一潔凈的載玻片，用特種筆在載玻片的左右兩側標上菌號，并在兩端各滴一小滴蒸餾水，以無菌接種環(huán)分別
4、挑取少量菌體涂片，干燥、固定。玻片要潔凈無油，否則菌液涂不開。??“三區(qū)”涂片法：在玻片的左、右端各加一滴蒸餾水，用無菌接種環(huán)挑取少量枯草芽孢桿菌與左邊水滴充分混合成僅有枯草芽孢桿菌的區(qū)域，并將少量菌液延伸至玻片的中央。再用無菌的接種環(huán)調取少量大腸桿菌與右邊的水滴充分混合成僅有大腸桿菌的區(qū)域，并將少量的大腸桿菌液延伸到玻片中央，與枯草芽孢桿菌相混合含有兩種菌的混合區(qū)，干燥、固定。要用活躍生長期的幼培養(yǎng)物作革蘭氏染色；涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽性。2.染色（1）初染：于制片上滴加結晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余
5、染料。（2）媒染：，用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1min，水洗。（3）脫色：用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時，立即水洗，終止脫色，將載玻片上水甩凈。????革蘭氏染色結果是否正確，乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關鍵環(huán)節(jié)。脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌。脫色時間一般約20～30s。（4）復染：滴加番紅液，染色2min，水洗。在染色的過程中，不可使染液干涸。3.鏡檢：用濾紙吸干，油鏡鏡檢（先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當的視野后，將
6、高倍鏡轉出，在涂片上加香柏油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細調焦觀察），判斷兩種菌體染色反應性。菌體被染成藍紫色的是革蘭氏陽性菌（G+），被染成紅色的為革蘭氏陰性菌（G-）。注意事項（1）選用活躍生長期菌種染色，老齡的革蘭氏陽性菌會被染成紅色而造成假陰性。（2）圖片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽性。（3）脫色是革蘭氏是否成功的關鍵，脫色不夠造成假陽性，脫色過度造成假陰性。實驗結束后處理清潔顯微鏡。先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少許二甲苯擦去鏡頭上的殘留油跡，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗
7、，涼干后備用。六、實驗報告1.列表填出油鏡下觀察到的兩種菌的菌體顏色、細菌形態(tài)、染色結果（G+、G-）2.在下表中依次填入革蘭氏染色所用染料的名稱，并填上革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌在每步染色后菌體所呈的顏色。步驟所用染料菌體所呈顏色革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌12343.革蘭氏染色是否成功，有哪些問題需要注意，為什么？4.當你對一株未知菌進行革蘭氏染色時，怎樣才能確保你的操作正確、結果可靠？細菌的芽孢染色一、目的要求學習芽孢染色的原理和方法二、實驗材料1.菌種：枯草芽孢桿菌，肉汁斜面培養(yǎng)24h；2.染料：5%孔雀綠水溶液、0.5%蕃
8、紅水溶液3.其他：顯微鏡、載玻片、接種環(huán)、香柏油、二甲苯等。三、實驗原理芽孢又叫內生孢子，是某些細菌生長到一定階段在菌體內形成的休眠體，通常呈圓形或橢圓形。細菌能否形成芽孢以及芽孢的形狀、位置，芽孢囊是否膨大等特征都是鑒定細菌的依據。由于芽孢壁厚、透性差、不易著色。當用結晶紫
