實(shí)驗(yàn)四線粒體和液泡系的超活染色與觀察

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1、實(shí)驗(yàn)四線粒體和液泡系的超活染色與觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并了解線粒體和液泡系超活染色的基本原理、方法和注意事項(xiàng)；了解植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡系的形態(tài)、數(shù)量與分布；二、實(shí)驗(yàn)原理活體染色是指對(duì)生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織能著色但又無(wú)毒害的一種染色方法。它的目的是顯示生活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，而不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以致引起細(xì)胞的死亡。活染技術(shù)可用來研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。根據(jù)所用染色劑的性質(zhì)和染色方法的不同，通常把活體染色分為體內(nèi)活染與體外活染兩類。體內(nèi)活染是以膠體狀的染料溶液注入動(dòng)、植

2、物體內(nèi)，染料的膠粒固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊結(jié)構(gòu)里，達(dá)到易于識(shí)別的目的。體外活染又稱超活染色，它是由活的動(dòng)、植物分離出部分細(xì)胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色。活體染料之所以能固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊的部分，主要是染料的“電化學(xué)”特性起重要作用。堿性染料的膠粒表面帶陽(yáng)離子，酸性染料的膠粒表面帶陰離子，而被染的部分本身也是具有陰離子或陽(yáng)離子，這樣，它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作為活體染色劑之用，應(yīng)選擇那些對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性或毒性較小的染料，而且總是要配成稀淡的溶

3、液來使用。一般是以堿性染料最為適用，可能因?yàn)樗哂腥芙庠陬愔|(zhì)（如卵磷脂、膽固醇等）的特性，易于被細(xì)胞吸收。詹姆斯綠B（JanusgreenB）和中性紅（neutralred）兩種堿性染料是活體染色劑中最重要的染料，對(duì)于線粒體和液泡系的染色各有專一性。詹納斯綠B是線粒體的專一性活體染色劑，線粒體中細(xì)胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態(tài)（即有色狀態(tài)）呈藍(lán)綠色，而在周圍的細(xì)胞質(zhì)中染料被還原，成為無(wú)色狀態(tài)。中性紅為弱堿性染料，3-氨基-6甲氨基-2-甲基吩嗪鹽酸鹽。對(duì)液泡系的染色有專一性，只將活細(xì)胞中的液泡系染成紅色，細(xì)胞核

4、與細(xì)胞質(zhì)完全不著色，這可能是與液泡中某些蛋白質(zhì)有關(guān)。線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，線粒體內(nèi)膜上分布有細(xì)胞色素氧化酶，該酶能使詹姆斯綠B保持在氧化狀態(tài)，呈現(xiàn)藍(lán)綠色從而使線粒體顯色，而細(xì)胞質(zhì)中的染料被還原成無(wú)色。液泡是細(xì)胞內(nèi)濃縮產(chǎn)物的主要場(chǎng)所，有十分重要的功能。中性紅是液泡的特殊染色劑，將液泡染成紅色。在活細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核不著色。如果細(xì)胞死亡，染料會(huì)彌散開來，使核著色。三、實(shí)驗(yàn)用品（一）器材顯微鏡、恒溫水浴鍋、解剖盤、剪刀、鑷子、雙面刀片、載玻片、載玻片、蓋玻片、表面皿、吸管、牙簽、吸水紙等。（二）試劑1、Rin

5、ger溶液氯化鈉0.85g（變溫動(dòng)物用0.65g）；氯化鉀0.25g；氯化鈣0.03g；蒸餾水100ml2、10%、1/3000中性紅溶液稱取0.5中性紅溶于50mlRinger溶液，稍加熱（30~40度）使之很快溶解，用濾紙過濾，裝入棕色瓶于暗處保存，否則易氧化沉淀，失去染色能力。臨用前，取已配制的1%中性紅溶液1ml，加入29mlRinger溶液混勻，裝入棕色瓶備用。3．1%、1/5000詹姆斯綠B溶液稱取50mg詹姆斯綠B溶于5mlRinger溶液中，稍加微熱（30~40度）使之溶解，用濾紙過濾后，即為1%

6、原液。取1%原液1ml加入49mlRinger溶液，即成1/5000工作液，裝入瓶中備用。最好現(xiàn)用現(xiàn)配，以保持它的充分氧化能力。（三）材料人口腔上皮細(xì)胞小麥根尖細(xì)胞四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）線粒體的超活染色與觀察1、線粒體是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場(chǎng)所，其形態(tài)和數(shù)量雖不同物種、不同組織器官和不同的生理狀態(tài)而發(fā)生變化。1）人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色與觀察⑴取清潔載玻片放在37℃恒溫水浴鍋的金屬板上，滴2滴1/5000詹納斯綠B染液。⑵實(shí)驗(yàn)者用牙簽寬頭在自己口腔頰部粘膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞，將第一次刮下的粘液狀物洗去，將第

7、二次刮下的粘液狀物放入載玻片的染液滴中，染色10～15min（注意不可使染液干燥，必要時(shí)可再加滴染液），蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置顯微鏡下觀察。⑶在低倍鏡下，選擇平展的口腔上皮細(xì)胞，換高倍鏡或油鏡進(jìn)行觀察?？梢姳馄綘钌掀ぜ?xì)胞的核周圍胞質(zhì)中分布著一些被染成藍(lán)綠色的顆粒狀或短棒狀的結(jié)構(gòu)，即線粒體。四、實(shí)驗(yàn)步驟二、液泡系的超活染色與觀察中性紅為弱堿性染料，對(duì)液泡系（即高爾基體）的染色有專一性，只將活細(xì)胞中的液泡系染成紅色，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)完全不著色，這可能是與液泡中某些蛋白質(zhì)有關(guān)。小麥根尖細(xì)胞液泡系的中性

8、紅染色觀察⑴　實(shí)驗(yàn)前，把小麥培養(yǎng)在培養(yǎng)皿內(nèi)潮濕的濾紙上，使其發(fā)芽，胚根生長(zhǎng)到1cm以上備用。⑵　用雙面刀片把小麥幼苗根尖（約1～2cm長(zhǎng)）小心切一縱切面，放入載玻片上的1/3000中性紅染液滴中，染色5～10min。⑶　吸去染液，滴一滴Ringer液，蓋上蓋玻片，并用鑷子輕輕地下壓蓋玻片，使根尖壓扁，利于觀察。⑷　在高倍鏡下，先觀察根尖部分的生長(zhǎng)點(diǎn)的細(xì)胞，可見細(xì)胞質(zhì)中散在