第7章+蛋白質(zhì)分離純化與表征

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1、第7章蛋白質(zhì)的分離純化和表征蛋白質(zhì)分離純化是利用其特性的差異分子的大小和形狀酸堿性質(zhì)溶解度吸附性質(zhì)對(duì)配體分子的特異生物學(xué)親和力蛋白質(zhì)純化應(yīng)根據(jù)研究工作和生產(chǎn)的具體目的和要求，制訂分離純化的合理程序。蛋白質(zhì)含有酸/堿AA殘基具有兩性堿/酸越大——pI越大pI通常在6.0左右一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)的分子量一般在一萬至一百萬道爾頓之間1道爾頓＝1×C12絕對(duì)質(zhì)量/12≈1.66×10-27千克二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的原理和方法（一）根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子質(zhì)量（二）滲透壓法測(cè)

2、定相對(duì)分子質(zhì)量（三）蛋白質(zhì)的擴(kuò)散和擴(kuò)散系數(shù)（四）沉降分析法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量（五）凝膠過濾法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量（六）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量（一）根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最小分子量1、測(cè)定蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量2、假設(shè)蛋白質(zhì)中僅含一個(gè)鐵原子最低相對(duì)分子質(zhì)量=100*55.8/鐵的百分含量例如肌紅蛋白含鐵量為0.335%，那么其最低相對(duì)分子質(zhì)量就是55.8/0.335×100=16700（五）凝膠過濾法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)分子通過凝膠柱的速度并不取決于分子的質(zhì)量，而是它的斯托克半價(jià)。如果某種蛋白

3、質(zhì)與一理想的非水化球體過柱速度相同，則認(rèn)為具有與該球體相同的半徑，稱斯托克半徑蛋白質(zhì)混合樣標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（已知Mr和斯托克半徑）和待測(cè)蛋白質(zhì)必須具有相同的分子形狀（接近球形）（六）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)顆粒在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，它的遷移率取決于：所帶電荷分子量分子形狀但是如果在該系統(tǒng)中添加SDS和少量巰基乙醇，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的相對(duì)分子質(zhì)量。十二烷基磺酸鈉原態(tài)蛋白質(zhì)變性？磺酸基極性親水烷基親油（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）遷移率與電荷和形狀無關(guān)，僅取決于相對(duì)分子質(zhì)量巰基乙醇

4、破壞二硫鍵蛋白質(zhì)分子的形狀蛋白質(zhì)分子在溶液中的形狀或構(gòu)象的信息，可借助其摩擦系數(shù)與理想球體的摩擦系數(shù)之比，也就是所謂的蛋白質(zhì)分子的摩擦比來推測(cè)。摩擦比越大，蛋白質(zhì)分子的不對(duì)稱性越高。三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀（一）膠體性質(zhì)（colloidalsystem）膠體溶液的特點(diǎn)：分子直徑在1-100nm內(nèi)溶于水不易聚集沉淀大多數(shù)球狀蛋白能形成穩(wěn)定的親水膠體溶液蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：1.同種蛋白帶同種電荷，相互排斥2.水膜彈性3.質(zhì)點(diǎn)的大小（1～100nm）蛋白質(zhì)溶液具有丁達(dá)爾效應(yīng)、布朗運(yùn)動(dòng)以及不能通過

5、半透膜等性質(zhì)（二）蛋白質(zhì)的沉淀Pr從膠體溶液中析出任何破壞穩(wěn)定蛋白質(zhì)溶液的因素都可能使蛋白質(zhì)沉淀I可逆沉淀溫和條件，改變?nèi)芤簆H或Pr所帶電荷Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒有變化適當(dāng)條件下可重新溶解——非變性沉淀pI沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等不可逆沉淀強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件破壞Pr膠體溶液穩(wěn)定性也破壞Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沉淀不能再重新溶解——變性沉淀如加熱沉淀、強(qiáng)酸/堿沉淀、重金屬鹽和生物堿沉淀等Ⅱ1.鹽析法加入大量中性鹽（硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉）脫去蛋白質(zhì)的水化層，鹽析一般不引起變性等電點(diǎn)沉淀的蛋白質(zhì)溶液中加入NaCl后沉淀溶

6、解—鹽溶原因？鹽溶—鹽析分子在等電點(diǎn)時(shí)，相互吸引，聚合沉淀，加入少量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中鹽溶鹽析向蛋白質(zhì)溶液中加入大量硫酸銨后蛋白質(zhì)會(huì)沉淀析出原因？蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀鹽析（（NH4）2SO4）2.有機(jī)溶劑沉淀脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用3.等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)分子帶有相同數(shù)量的正負(fù)電荷，因此，蛋白質(zhì)分子相互吸引，從而聚集沉淀。4.重金屬鹽沉淀與帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)結(jié)成不溶性鹽5.生物堿試劑和某些酸類沉淀與帶正電荷蛋白質(zhì)生成不溶性鹽6.加熱變性沉淀天然結(jié)構(gòu)解體

7、，疏水基外露，破壞水化層及帶電狀態(tài)四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則總目標(biāo)：增加制品純度或比活1.前處理：因動(dòng)/植物/細(xì)菌而異2.粗分級(jí)分離：采用鹽析/等電點(diǎn)沉淀/有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法3.細(xì)分級(jí)分離：采用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等4.結(jié)晶是最后步驟五、蛋白質(zhì)的分離純化方法（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法1、透析和超過濾利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜將其與小分子物質(zhì)分開半透膜為玻璃紙或纖維素材料血液透析小分子溶出小分子被帶出透析機(jī)透析液加壓血液2、密度梯度（區(qū)帶）離心用一定的介質(zhì)（如蔗糖）在離

8、心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將蛋白質(zhì)混合液置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場(chǎng)的作用使蛋白質(zhì)分層、分離。3、凝膠過濾3.凝膠過濾（二）利用溶解度差別的純化方法1.等電點(diǎn)沉淀調(diào)整溶液pH不同蛋白在各自pI處依次沉淀2.鹽溶和鹽析3.有機(jī)溶劑分級(jí)分離法降低介電常數(shù)爭(zhēng)奪水化膜影響溶解度的外部因素有：pH值、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度。4.溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶劑度的影響（三)根據(jù)電荷不同的分離方法1.電泳原理：蛋白質(zhì)在非等電點(diǎn)時(shí)所帶總電