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《AFLP分子標(biāo)記技術(shù)在海洋貝類遺傳結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用【文獻(xiàn)綜述】》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述生物技術(shù)AFLP分子標(biāo)記技術(shù)在海洋貝類遺傳結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用摘要PCR技術(shù)的出現(xiàn)是DNA遺傳分析的一場(chǎng)革命,以PCR為基礎(chǔ)的DNA指紋技術(shù)大大加快了人類研究生物遺傳多樣性的步伐,為不同來(lái)源和不同復(fù)雜程度基因組的分析提供由Zabeau等1992年創(chuàng)立的AFLP(Amplifiedfragmentlengthpolymorphism)技術(shù)是國(guó)際上最新的DNA指紋技術(shù)。該技術(shù)是在PCR技術(shù)和RFLP標(biāo)記技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)明的DNA指紋技術(shù)。該技術(shù)兼有RFLP標(biāo)記技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性,
2、而且快速、靈敏、穩(wěn)定,所需DNA量少,多態(tài)性檢出效率高、重復(fù)性好,不管所研究的基因組DNA有多么復(fù)雜,用該方法都可以檢測(cè)出任何DNA之間的多態(tài)性等優(yōu)點(diǎn)。所以該標(biāo)記技術(shù)被認(rèn)為是一種有效和先進(jìn)的分子標(biāo)記,被認(rèn)為是第2代分子標(biāo)記,現(xiàn)已被廣泛用于遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性研究、基因定位和品質(zhì)鑒定等方面。1、AFLP分子標(biāo)記技術(shù)的基本原理AFLP標(biāo)記技術(shù)的基本原理是利用PCR技術(shù)和凝膠電泳技術(shù)對(duì)基因組DNA的雙酶切片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增、電泳分離來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增的DNA片段的長(zhǎng)度多態(tài)性。一般用EcoRI和MseI限制性
3、內(nèi)切酶將基因組DNA進(jìn)行雙酶切,然后將酶切片段和接頭(adapter)連接,連接產(chǎn)物作為預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)的模板,接頭序列加1個(gè)選擇性堿基作為預(yù)擴(kuò)增引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增,其擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板,用含223個(gè)選擇性堿基的引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。擴(kuò)增片段經(jīng)過(guò)變性聚丙烯酰胺電泳分離、銀染或自顯影檢測(cè),即可獲得大量的DNA譜帶。對(duì)同一基因組DNA而言,引物的選擇性堿基數(shù)目越多,擴(kuò)增出來(lái)的帶就越少;反之,擴(kuò)增出來(lái)的帶就多。2、AFLP分子標(biāo)記技術(shù)的基本流程與方法改進(jìn)AFLP分析過(guò)程包括3個(gè)步驟:(1)DNA酶切及人工接頭的連接(
4、RestrictionoftheDNAandligationofoligonucieotidcadapters)。AFLP技術(shù)革新成功的關(guān)鍵在于DNA的充分酶切,所以對(duì)模板質(zhì)量要求較高,避免其他DNA污染和抑制物質(zhì)的存在。(2)限制性片段的選擇性擴(kuò)增(Selectiveamplificationofsetsofrestrictionfragments)。選擇性擴(kuò)增前,首先用單選擇堿基的引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增反應(yīng),預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋后用于選擇性擴(kuò)增反應(yīng)。采用這種兩步法為以后的分析提供大量的模板,同時(shí)對(duì)模板起到選
5、擇性純化的作用,從而使產(chǎn)生的指紋圖譜更清晰和具有更好的重復(fù)性。(3)擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析(Gelanalysisoftheamplifiedfragments)。擴(kuò)增產(chǎn)物通常在4%~6%的變性聚丙烯酞胺凝膠上分離,然后根據(jù)引物的標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行相應(yīng)的產(chǎn)物檢測(cè)。AFLP技術(shù)作為新一代的分子標(biāo)記技術(shù),自從其誕生以來(lái),已有大量文章開(kāi)始發(fā)表,但它與其它分子標(biāo)記一樣也存在許多不足之處。近幾年來(lái),AFLP技術(shù)有了很大改善與發(fā)展,如采用單酶切或三酶切等。單酶切AFLP技術(shù)這種方法是在傳統(tǒng)的AFLP技術(shù)基礎(chǔ)上以改進(jìn)。
6、采用一種酶,一個(gè)接頭,酶切連接反應(yīng)在一個(gè)反應(yīng)內(nèi)進(jìn)行,使用瓊脂糖凝膠電泳代替變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。這種單酶切的方法能增加擴(kuò)增帶的特異性,減少弱帶,每個(gè)引物多態(tài)位點(diǎn)數(shù)多,所需時(shí)間短,實(shí)驗(yàn)過(guò)程較傳統(tǒng)的AFLP技術(shù)簡(jiǎn)單??捎糜贒NA指紋圖譜構(gòu)建,改進(jìn)的單酶切AFLP技術(shù)的重復(fù)性,可靠性,應(yīng)用性都大大加強(qiáng),且能用于病原菌的快速鑒定。SAMPL(selectiveamplificationofmicrosatellitepolymorphicloci)指紋技術(shù)是在AFLP基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種指紋技術(shù)。利用與
7、AFLP相同的模板并經(jīng)過(guò)雙酶切、對(duì)應(yīng)接頭連接和預(yù)擴(kuò)增。所用引物對(duì)中一個(gè)是AFLP選擇性引物,一個(gè)是包含一段復(fù)雜微衛(wèi)星序列的SAMPL引物,由于微衛(wèi)星座位是基因組高變區(qū),從而再對(duì)遺傳變異低的樣本進(jìn)行分析時(shí),SAMPL分析就顯得更加靈敏、高效,能有效的顯示關(guān)系較近的基因組高變異區(qū)微衛(wèi)星位點(diǎn)的不同,評(píng)估種群內(nèi)遺傳變異,其檢測(cè)出的多態(tài)百分?jǐn)?shù)比AFLP技術(shù)的高。TE—AFLPTE—AFLP(threeendonuclease2AFLP)即三內(nèi)切酶擴(kuò)增的限制性長(zhǎng)度多態(tài)性,是由荷蘭科學(xué)家derWurff在AFL
8、P技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的指紋技術(shù)。用兩種低頻率切點(diǎn)內(nèi)切酶(通常為6堿基位點(diǎn)識(shí)別酶)和1種高頻率切點(diǎn)內(nèi)切酶(通常為4堿基位點(diǎn)識(shí)別酶)代替了AFLP技術(shù)的雙酶切,但仍用兩個(gè)接頭連接,產(chǎn)生的片段只與低頻率切點(diǎn)內(nèi)切酶所切片段末端有共同粘性末端的2個(gè)人工接頭連接,選擇性擴(kuò)增的引物末端加上1~2個(gè)選擇性核苷酸,使既能與接頭粘性末端配對(duì)又能與引物的選擇性核苷酸配對(duì)的限制性片段得到擴(kuò)增。這種方法可以減少傳統(tǒng)AFLP技術(shù)中帶的數(shù)量,提高復(fù)雜基因組的分辨能力。AFLP標(biāo)記的多態(tài)是通過(guò)限制位點(diǎn)的選