腎癌組織中wnt5a的表達(dá)及其臨床意義

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1、腎癌組織中Wnt5a的表達(dá)及其臨床意義［摘要］目的探討Wnt5a在腎癌組織屮的表達(dá)與病理意義以及對腎癌細(xì)胞增殖及侵襲潛能的影響，為尋找腎癌有效的治療途徑及預(yù)后判定指標(biāo)提供依據(jù)。方法對43例腎癌組織標(biāo)本和11例正常腎組織標(biāo)本中的Wnt5amRNA和Wnt5a蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，分析腎癌組織Wnt5amRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，及Wnt5a蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果Wnt5amRNA和Wnt5a蛋白在腎癌組織屮的陽性表達(dá)率均顯著高于正常腎組織(P〈0.05)o腎鱗癌的Wnt5amRNA表達(dá)水平明顯高于腎腺癌(P<0.01)；低分化組顯著高于高分化組

2、(P<0.01)oWnt5a蛋白陽性的腎癌患者2年生存率明顯低于陰性患者(P<0.01)o結(jié)論Wnt5a表達(dá)水平在腎癌細(xì)胞中明顯增高，且與腎癌的細(xì)胞分化程度、組織類型及預(yù)后密切相關(guān)，提示W(wǎng)nt5a可能參與腎癌的發(fā)生發(fā)展過程。［關(guān)鍵詞］Wnt5a；腎癌細(xì)胞；侵襲轉(zhuǎn)移；影響［中圖分類號］R737.11［文獻(xiàn)標(biāo)識碼］A［文章編號］1673-7210(2013)08(c)-0029-03腎癌是一種發(fā)病率較高的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率呈逐步增高的態(tài)勢［1］。有研究報(bào)道，約有1/5發(fā)病的惡性腫瘤為腎癌，在總癌癥死亡數(shù)中因腎癌死亡的占23?8%［2］。雖然近年來隨著

3、各種新手段、新方法、新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，但有關(guān)腎癌患者總生存率方面的研究仍然沒有取得實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt5a的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示患者短生存期及預(yù)后不良。因此，深入研究Wnt5a與腎癌的關(guān)系具有重要意義。1資料與方法1.1一般資料選取南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院2011年3月?2012年3月收治的43例腎癌患者，其中，男31例，女12例；年齡32?72歲，平均（56.7±4.5）歲；I?II期21例，III?IV期22例。均經(jīng)手術(shù)治療及病理學(xué)確診，術(shù)前未接受放、化療，均有完整的術(shù)后隨訪記錄，牛存時間的計(jì)算從手術(shù)日期到由于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而死亡

4、的日期或末次隨訪日期為止，隨訪期1?24個月。另選取11例非腎癌病例的正常腎組織作為對照，其中，男7例，女4例;年齡30?65歲,平均（50.4±4.8）歲。1.2方法43例腎癌組織標(biāo)本和11例正常腎組織標(biāo)本均為于術(shù)時獲取，所有標(biāo)木分成兩份，一份于無菌條件下釆集，并放入經(jīng)二乙基焦碳酸酯（DEPC）處理過的Ep管內(nèi)，液氮保存，行熒光實(shí)時定量RT-PCR,檢測Wnt5amRNA表達(dá)水平；一份于10%中性福爾馬林中固定，石蠟包埋處理、保存，行Wnt5a蛋白的免疫組化染色。1.2.1熒光實(shí)時定量RT-PCR檢測腎癌組織和正常腎組織Wnt5amRNA表達(dá)1.2.

5、1.1標(biāo)本處理將50?100mg組織標(biāo)本放入Ep管中，剪碎，加入1mLTrizol,勻漿。1.2.1.2RNA分離吸入1.5mLEp管內(nèi),室溫靜置5min；加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩Ep管15s后，室溫孵育5min；配平，4°C12000r/min離心15mino1.2.1.3RNA沉淀吸取上層水相，置于另一個1.5mLEp管屮，加入0.5mL異丙醇，充分混勻后-20°C放置1h,4°C10000r/min離心10min。1.2.1.4RNA清洗棄上清,加入75%的乙醇1mL,室溫放置5min；4°C10000r/min離心10min,移去上清，吹干

6、、沉淀。1.2.1.5RNA再溶解去乙醇，室溫干燥5min；加入100uLDEPC處理的ddH20,取3uL加3mLddH20,10uL電泳，其余標(biāo)本放入-70°C保存。1.2.1.6RNA濃度測定用99nLDEPC水稀釋、混勻，用紫外分光光度計(jì)分析、計(jì)算RNA濃度。1.2.1.7RNA完整性檢測制備1?5%瓊脂糖凝膠，行RNA完整性檢測。于紫外燈透視下觀察電泳結(jié)果，應(yīng)可見3條28s、18s和5sRNA的清晰條帶。將完整的RNA樣品保存于-80°C冰箱備用。1.2.1.8eDNA第一條鏈合成取1ug總RNA應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄以合成第一條鏈eDNA

7、,-20°C保存?zhèn)溆谩?.2.1.9檢測實(shí)時熒光定量PCR檢測目的基因和內(nèi)參基因表達(dá)。1.2.2免疫組化染色檢測腎癌組織和正常腎組織Wnt5a蛋白表達(dá)經(jīng)載玻片處理、石蠟切片、脫蠟、水化后，用3%H202孵育10min,蒸館水漂洗1minX3次，PBS浸泡5min,將抗原微波修復(fù)15min后，室溫放置30min,PBS漂洗1minX3次，加入5%?10%山羊血清封閉，室溫放置10min,加入一抗，37°C孵育2h,PBS漂洗5minX3次，加入二抗，37°C孵育20min,PBS漂洗5minX3次，加入DAB顯色，沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。1.

8、3判斷標(biāo)準(zhǔn)Wnt5amRNA陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：RT-PCR產(chǎn)物電泳后在紫外光下出現(xiàn)一條538bp的