腎癌患者腎癌組織microRNA差異表達及可能的臨床意義

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1、中山大學博七學位論文腎癌患者腎癌組織microRNA差異表達及可能的臨床意義腎癌患者腎癌組織microRNA差異表達及可能的臨床意義專業(yè)：內科學(腎臟病學)研究生：李明導師：余學清教授中文摘要腎癌，又稱腎細胞癌(renalcellcarcinoma,RCC)，其發(fā)病率占全身惡性腫瘤的3％，在病理上75％表現(xiàn)為透明細胞癌，不同病理類型的腎癌具有不同的臨床特點、治療方案和預后。血尿、疼痛、腫塊稱為腎癌的三聯(lián)征。l臨床上有30％一50％病例系偶然發(fā)現(xiàn)的無癥狀患者，而有癥狀者在診斷時大都已有或將發(fā)生轉移病變。目前腎癌的主要治療方法是外科手

2、術根治，但既使早期患者手術治療后，仍有部分患者將發(fā)生轉移。轉移性腎癌預后較差，對放化療等治療不敏感，3年平均存活率低于5％。因此，深入了解腎癌的發(fā)病機制，并在此基礎上探索早期診斷和治療方法有著重要的意義。目前腎癌的研究主要從蛋白組學、基因組學和microRNA(miRNA)組學等幾方面來探討腎癌的發(fā)病機制和尋找疾病早期診斷的分子標記物。其中miRNAs是近來才發(fā)現(xiàn)的一種小RNA，長度為22個核苷酸左右，可以結合靶基因的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)來降解靶基因的mRNA或者抑制蛋白質翻譯。miRNAs作為轉錄后水平上的調控因子，在個體

3、的生長發(fā)育和細胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學過程中發(fā)揮重要作用。越來越多的證據表明miRNAs與腫瘤的發(fā)生有密切的關系，起著癌基因或抑癌基因的作用。機體內基因與miRNAs之間存在著相互作用，具體表現(xiàn)為一個miRNA可以有多個靶基因，而一個靶基因也可以調節(jié)多個miRNA，在一起交織成一個復雜的網絡。已有的研究都是進行miRNA的表達譜分析，再進行靶基因的預測以了中山大學博士學位論文腎癌患者腎癌組織microRNA差異表達及可能的臨床意義解它們之間的相互關系，這種方法不能全面地了解機體的基因調控網絡。并且都是采用芯片的方法進行表達

4、譜分析，而芯片具有假陽性高，不能檢測低豐度表達的基因和miRNAs，不能鑒別新的miRNAs等缺陷，新一代測序技術因其高通量，高精確性可以彌補這一不足。為了全面系統(tǒng)地了解腎癌患者腎癌組織的miRNA表達差異及可能的臨床意義，我們擬以腎透明細胞癌這一最多見的腎癌病理類型為研究對象，采用新一代測序技術Solexa平臺，通過同時對miRNAs及基因的表達譜進行大規(guī)模比較基因組學研究，尋找腎癌中差異表達的miRNA和其相應的靶基因，從分子生物學水平上揭示miRNAs參與癌癥的可能生物機理。并且運用比較基因組學和系統(tǒng)生物學的手段，了解miR

5、NAs與靶基因作用的詳細機制，為腎癌的診斷及治療提供可靠翔實的分子生物學基礎。我們共選取六名腎透明細胞癌患者，其中性別和年齡相匹配的男女患者各三名，分別對他們的腎癌組織和癌旁正常組織進行miRNA和基因的表達譜分析。我們的研究共檢測到腎組織中有500多個miRNA的表達，其中200個miRNA的表達量較高。在所有腎癌患者的腎癌組織中約有64個miRNA的表達差異，其中下調表達的40個，上調表達的24個。我們將含有相同Seed(miRNA第2．8位)的miRNA聚類為同一家族，發(fā)現(xiàn)在男性患者中，18個miRNA家族在正常組織和癌組織

6、中表達存在顯著差異；在女性患者中，8個miRNA家族在正常組織和癌組織中表達存在顯著差異。同時，我們還發(fā)現(xiàn)了100多個新的候選miRNA。在基因表達譜分析中，共檢測到14000個基因，其中9400個基因的表達豐度較高。腎癌組織中以下調表達的基因為主。男女患者分別都有基因表達的差異；在所有患者中都有差異表達的基因共有28個，其中下調表達的基因26個，上調表達的基因2個。將這些基因進行功能分析，發(fā)現(xiàn)在下調表達的基因中有7個與代謝和信號通路相關，分別參與PPAR信號通路和脂肪酸和氨基酸等代謝途徑。同時，我們采用系統(tǒng)生物學的方法將基因和m

7、iRNA表達譜進行綜合分析。采用TargetScan運算方法，發(fā)現(xiàn)在下調表達的26個基因中有12個可能是潛在的miRNA的靶基因。鑒于miRNA是通過與靶基因的3’UTR結合來降解靶基因的mRNA，它們兩者之間的表達呈反向關系，那么推測這些miRNA在腎癌組織中山大學博士學位論文腎癌患者腎癌組織microRNA差異表達及可能的臨床意義中的表達應該升高。我們將在腎癌中上調表達的24個miRNA與它們進行比對，共發(fā)現(xiàn)有3個基因可能是上調表達的miRNA的靶基因。這3個基因分別是SLC4A4、CLCN5、GATM，而他們都是Iet．7的

8、靶基因。我們對這6個患者采用實時熒光定量PCR(real-timePCR)的方法進行差異表達的miRNA和mRNA的驗證，發(fā)現(xiàn)與測序結果相一致。隨后又我們采用另一患者群(共26個患者)對差異表達的miRNA進行驗證，并了解差異表達的miRNA與臨床