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《植物生理生化指標測定(精)》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、小黑豆相關生理指標測定1.表型變化:鮮重、株高、主根長和葉面積鮮重:取處理好的植株,擦干根和葉表面水分,測量整株植物的重量,每個測6個重復。株高:取處理好的植株,測量從根和莖分隔處到植株最高點的高度,記錄,每個測6個重復。主根長:取處理好的植株,測量從根和莖分隔處到主根最遠點長度,記錄,每個測6個重復。葉面積:取處理好的植株,選擇第二節(jié)段的葉片,測量葉面積,葉面積測量方法是測每個葉片最寬處長度作為葉的長,測葉片最窄處長度作為葉的寬,葉片長和寬的乘積即為葉表面積。每個測6個重復。2.總蛋白、可溶性糖、丙二醛(MDA和H2O2含量測定樣品處理:取0.5g樣品(葉片要去除葉脈、根要先
2、用清水清洗干凈,速在液氮中凍存,在遇冷的研缽中加液氮研磨,然后加入1.5ml的Tris-HCl(pH7.4抽提,將抽提液轉移到2ml的EP管中,于4℃,12000rpm離心15min,取上清,保存在-20℃下,上清液可用于總蛋白、丙二醛(MDA、可溶性糖和H2O2含量測定?？偟鞍诇y定(Bradford法:樣品反應體系(800ulH2O+200ulBradford+5ul樣品,空白對照為(800ulH2O+200ulBradford。測定后帶入標準曲線Y=32.549X-0.224(Y代表蛋白含量,X代表OD595,計算得出蛋白含量?？扇苄蕴菧y定:樣品反應體系(1ml蒽酮+180
3、ulddH2O+20ul樣品提取液;空白對照(1ml蒽酮+180ulddH2O,測定OD625后帶入標準曲線:Y=0.0345X+0.0204(Y代表OD625,X代表可溶性糖含量(ug蒽酮配方:稱取100mg蒽酮溶于100ml稀硫酸(76ml濃硫酸+30mlH2O.注意:濃硫酸加入水中時,一點一點遞加,小心濺出受傷。丙二醛(MDA測定:在酸性和高溫條件下,丙二醛可與硫代巴比妥(TBA反應生成紅棕色的3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮,在532nm處有最大吸收波長,但該反應受可溶性糖的極大干擾,糖與TBA的反應產(chǎn)物在532nm處也有吸收,但其最大吸收波長在450nm處。采用雙組
4、分分光光度法,可計算出MDA含量。MDA的計算公式為:MDA(umol/L=6.45OD532-0.56OD450.反應體系為:400ul0.6%TBA+350ulH2O+50ul樣品,80℃水浴10min后,測OD532和OD450。對照用Tris-HCl.0.6%TBA配方:稱取硫代巴比妥0.6g,溶于少量1MNaOH中,待其完全溶解后用10%TCA(稱取10gTCA三氯乙酸,溶于100ml蒸餾水中,待其溶解即可定容至100ml。H2O2測定(二甲酚橙法:樣品反應體系(82ul溶液A+820ul溶液B(A:B=1:10+150ul樣品提取液,30℃水浴30min,測OD56
5、0。標準曲線為:Y=0.01734X-0.0555(Y代表OD560,X代表H2O2含量溶液A(200ml:FeSO4.7H2O0.1835g;(NH42SO40.0872g;H2SO4(濃硫酸18M4.58ml,加水定容。溶液B(200ml:二甲酚橙0.0234g;山梨醇6g,加水定容到200ml3.可溶性蛋白、SOD、POD和CAT活性測定樣品處理:取0.5g樣品,速在液氮中凍存,在遇冷的研缽中加液氮研磨,然后加入1.5ml的Tris-HCl(pH7.0(內(nèi)含有20%甘油、1mmol/LASA(抗壞血酸、1mmol/LDTT(二硫蘇糖醇、1mmol/LEDTA、1mmol/
6、LGSH(還原型谷胱甘肽、5mmol/LMgCl2抽提,將抽提液轉移到2ml的EP管中,于4℃,12000rpm離心15min,取上清,保存在-20℃下,上清液可用于可溶性蛋白、SOD、POD和CAT含量測定。1mmol/L的ASA配制:先配制10mmol/L的母液—稱取176.13mg的ASA,溶于100ml的Tris-HCl(pH7.0中即可,然后稀釋10倍即可。1mmol/L的DTT配制:先配制10mmol/L的母液—稱取154.25mg的DDT溶于100ml的Tris-HCl(pH7.0中即可,然后稀釋10倍即可。1mmol/L的EDTA配制:用30mmol/L的EDT
7、A稀釋30倍即可。5mmol/L的MgCl2配制:稱取MgCl2.6H2O的101.5mg溶于100ml的Tris-HCl(pH7.0,即可。樣品提取液的配制(200ml:取10mmol/L的ASA母液20ml,10mmol/L的母液DTT20ml,取30mmol/L的EDTA母液7ml,稱取203mg的MgCl2.6H2O,最后再量取20ml的甘油,將最終體積定容到200ml,即可?？扇苄缘鞍诇y定(Bradford法:樣品反應體系(800ulH2O+200ulBradford+5ul樣品,
