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1、實驗22過氧化物酶活性的測定過氧化物牌是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶，它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有密切關系，在植物生長發(fā)育過程中，它的活性不斷發(fā)生變化，因此測量這種酶，可以反映某一時期植物體內(nèi)代謝的變化。通過本實驗了解過氧化物酶的作用，掌握常用的測定過氧化物酶的方法一愈創(chuàng)木酚法。一、原理在過氧化物酶(peroxidase)催化下,H2O2將愈創(chuàng)木酚氧化成茶褐色產(chǎn)物。此產(chǎn)物在470m處有最大光吸收，故可通過測470nm下的吸光度變化測定過氧化物酶的活性。二、材料、儀器設備及試劑(一)材料馬鈴薯塊莖。(二)儀器設備722型分光光
2、度計，離心機，研缽，容量瓶，量筒，試管，吸管。(三)試劑(1)0.05mol/L.pH5.的磷酸緩沖液。(2)0.05mo/L愈創(chuàng)木份溶液。(3)2%H202。(4)20%三氯乙酸。三、實驗步驟(一)酶液的制備取5.0g洗凈去皮的馬鈴薯塊莖，切碎放入研缽中，加適量的磷酸緩沖液研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)人離心管中,于3000g離心10min,上清被轉(zhuǎn)人25mL,容量瓶中。沉淀用5mL磷酸緩沖液再提取兩次，上清液并人容量瓶中，定容至刻度，低溫下保存?zhèn)溆谩?二)過氧化物酶活性測定酶活性測定的反應體系包括:2.9mL.0.05mol/L磷酸緩沖液;1.0
3、ml.2%H2O2；1.0mL.0.05mol/L愈創(chuàng)木面和0.1mL酶液。用加熱煮沸5min的酶成為對照，反應體系加人酶液后，立即于37C水浴中保溫15min.然后迅速轉(zhuǎn)人冰浴中，并加人2.0ml.20%三氯乙酸終止反應，然后，過慮(或5000xg離心10min),適當稀釋.470mm波長下測定吸光度。四、結(jié)果計算以每分鐘內(nèi)A470變化0.01為1個過氧化物酶活性單位(u)。過氧化物酶活性=?A470×VTW×Vs×0.01×t[u/（g.min）]式中:?A470為反應時間內(nèi)吸光度的變化:W為馬鈴薯鮮重.g；t為反應時間，mins；VT為提取
4、酶液總體積，ml；Vs為測定時取用酶液體積，mL。實驗24超氧化物歧化酶（SOD）活性測定（氮藍四唑光化還原法）一、原理超氧物歧化酶(Superxidedismtae,SOD)普遍存在于動、植物體內(nèi)，是一種清除超氧陰離子自由基(O2-的酶,它催化下列反應:2O2-+2H+H2O2+02反應產(chǎn)物H2O2可由過氧化氫酶進一步分解或被過氧化物酶利用。本實驗依據(jù)超氧物歧化酶抑制氮藍四唑(NBT)在光下的還原作用來確定酶活性大小。在有氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生O2-,O2-可將氮藍四唑還原為藍色的甲腙，后者
5、在560m處有最大吸收。而SOD可清除O2-，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應后，反應液藍色愈深，說明酶活性愈低,反之酶活性愈高。據(jù)此可以計算出酶活性大小。二、材料、儀器設備及試劑(一)材料水稻或小麥葉片。(二)儀器設備分光光度計，高速臺式離心機，研缽，容量瓶，量筒，試管，吸管，熒光燈。(三)試劑的配制（1）0.05mol/L磷酸緩沖液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液:取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.0
6、1）31.2g。分別用蒸餾水定容到1000ml。0.05mol/LPBS（pH7.8）的配制：分別取A母液(Na2HPO4)228.75ml，B母液(NaH2PO4)21.25ml，用蒸餾水定容至1000ml。加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399gMet用磷酸緩沖液（pH7.8）定容至100ml。（3）100μmol/LEDTA-Na2溶液：取0.03721gEDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至1000ml。（4）20μM核黃素溶液：取0.00753g核黃素用蒸餾水定容至1000ml，避光保存。（5）
7、750μmol/L氮藍四唑（NBT）溶液：稱取0.06133gNBT用磷酸緩沖液定容至100ml避光保存。三、實驗步驟酶液制備：取一定部位的植物葉片（視需要定，去葉脈）0.5g于預冷的研缽中，加1ml磷酸緩沖液在冰浴下研磨成漿，加緩沖液使終體積為5ml。取1.5--2ml于1000r/min下離心20min，上清液即為SOD粗提液。提取酶液時如何保存;如果沒有測完的需要放在4℃的冰箱里。顯色反應取試管（要求透明度好）4，2為樣品測定管，2為對照管，按表39-1加入各溶液?；靹蚝髮?支對照管置于暗處其他管于4000lx日光反應20min（要求各管受
8、光情況一致，反應室的溫度高時時間可適當縮短，溫度低時時間可適當延長）。表39-1各溶液加入量試劑（酶）用量(ml)終濃度（比色時）0.0
