熒光定量PCR技術(shù)專題.ppt

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1、TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD―qPCR系統(tǒng)“從RNA提取到熒光定量PCR”解決方案內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR解析方法SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析與常規(guī)PCR技術(shù)比較：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光定量PCR原理－－定義擴(kuò)增曲線熒光閾值Ct值熒光定量PC

2、R原理－－常用名詞概念Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）BaselineLg－linerphase平臺(tái)期熒光基團(tuán)熒光檢測(cè)元件熒光定量PCR原理－－擴(kuò)增曲線Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）BaselineLg－linerphase前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline）熒光閾值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動(dòng)設(shè)置：大于熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值；進(jìn)入指數(shù)期的最初階段真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過閾值Threshold熒光定量PCR原理－－熒光閾值平臺(tái)期Ct值的定義：PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所

3、經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）Ctvalue熒光定量PCR原理－－Ct值橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號(hào)量Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；Ct值極具重現(xiàn)性Ct值的重現(xiàn)性理想的PCR反應(yīng)Xn＝X02n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理非理想的PCR反應(yīng)Xn＝X0（1＋En）n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)En：擴(kuò)增效率熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到熒光閾值時(shí)XCt＝X0（1＋En

4、）Ct＝M（1）*XCt：熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在閾值設(shè)定以后，它是一個(gè)常數(shù)，定為M方程式（1）兩邊同取對(duì)數(shù)得：Log2M＝Log2X0*（1＋En）Ct（2）整理方程式（2）：Log2X0＝Log2M－CtLog2（1＋En）熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理CyclenumberCk104Ck102SampleLgofDNAconcentration模板DNA量越多，熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系。熒光定量PCR原理－－Ct值與模板起始量的關(guān)系線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)檢測(cè)靈敏度確認(rèn)Notem

5、platecontrol確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率:-3－-3.535Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果如果采用SYBR檢測(cè)方法，30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增35Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生相關(guān)系數(shù)（R2）：大于0.98熒光定量PCR反應(yīng)性的確認(rèn)PCR擴(kuò)增效率（E）:0.9-1.2內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR解析方法SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南非特異性熒光標(biāo)記SYBRGreenI特異性熒光標(biāo)記TaqManProbe常用熒光標(biāo)記方法SYBRGreenI染料法——原理SYBRGreenI是一

6、種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。SYBRGreenI熱變性引物退火延伸反應(yīng)SYBRGreenI染料法——作用機(jī)理問題點(diǎn)：SYBRGreenI與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合后散發(fā)熒光，因此如果反應(yīng)體系中有非特異性擴(kuò)增或引物二聚體的產(chǎn)生，也將同時(shí)被檢測(cè)，從而可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。SYBRGreenI染料法——問題點(diǎn)與關(guān)鍵點(diǎn)關(guān)鍵點(diǎn)：設(shè)計(jì)合適引物，防止非特異性擴(kuò)增！將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)(-dI/dT)原始圖譜對(duì)數(shù)圖譜SYBRGreenI染料法——融解曲線融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光

7、，因此定量不準(zhǔn)確SYBRGreenI染料法——融解曲線使用方便，不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針具有價(jià)格優(yōu)勢(shì)優(yōu)點(diǎn)無模板特異性對(duì)引物特異性要求較高不能進(jìn)行多重定量靈敏度相對(duì)較低缺點(diǎn)SYBRGreenI染料法——優(yōu)缺點(diǎn)Taqman探針法——原理5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針Taqman探針法——工作機(jī)理熱變性引物和探針與模板退火延伸反應(yīng)探針報(bào)告基團(tuán)淬滅基團(tuán)探針DNA聚合酶引物RRRR1、引

8、物、探針的設(shè)計(jì)：探針Tm為68-70℃