各種PCR介紹ppt課件.ppt

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1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)1根據(jù)細(xì)胞分裂中DNA半保留復(fù)制機(jī)理，在體外快速擴(kuò)增某一特定DNA片段的方法。2PCR工作原理以要擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)與模板5`末端和3`末端互補(bǔ)的寡核甘酸片段為引物4種脫氧核糖核甘酸存在的條件下依賴DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。PCR特異性取決于引物和模板DNA結(jié)合特異性。3體外(試管中)擴(kuò)增特異DNA片段短時(shí)間內(nèi)即可將所需目的DNA片段擴(kuò)增至100萬倍以上PCR技術(shù)特點(diǎn)敏感度高、特異性強(qiáng)、產(chǎn)率高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便、快速4PCR體系基本組成模板DNA：（102-5）拷

2、貝dNTP底物：20—200umol/L特異性引物：0.1—0.5umol/LDNA聚合酶：KlenowT4、T7聚合酶TaqDNA聚合酶:耐熱穩(wěn)定性、5`-3`聚合酶活性及3`-5`外切酶活性，可校正PCR反應(yīng)中某些單核甘酸的錯(cuò)配。含Mg2+的緩沖液：Mg2+能影響反應(yīng)特異性和擴(kuò)增片段的產(chǎn)率，一般為1.5—2.0mmol/L，過量將增加非特異性條帶的產(chǎn)生。5循環(huán)次數(shù)取決于模板DNA的濃度30次—擴(kuò)增100萬倍6反應(yīng)分三步：1變性denaturation：加熱90-95℃，模板DNA雙鏈解離形成單鏈DNA；2退火annealling：溫度突然

3、降低,引物與模板DNA結(jié)合,40-60℃,Tm值{4（G+C）+2（A+T）}-5℃.3延伸extension：TaqDNA聚合酶以4dNTP為底物，在Mg2+存在的條件下，催化DNA合成。70-75℃時(shí)間---要擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定7待擴(kuò)增片段：1000bp引物Tm＝55℃DNA模板變性:94℃,5分鐘;PCR循環(huán)(30次):94℃,30秒;50℃,45秒;72℃,1分鐘;最終延伸:72℃,10分鐘PCR反應(yīng)條件的設(shè)定8PCR產(chǎn)物的檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳；分子雜交；限制性內(nèi)切酶酶切分析；微孔板夾心雜交法；直接測(cè)序9PCR產(chǎn)物的檢測(cè)-瓊脂糖凝膠電泳P

4、CR產(chǎn)物PCR產(chǎn)物10PCR技術(shù)的應(yīng)用1.基礎(chǔ)研究(1)基因或cDNA克?。簭幕驍?shù)據(jù)庫(kù)中獲得某一基因或cDNA的核苷酸序列，用PCR方法擴(kuò)增并克隆該基因或cDNA。(2)基因表達(dá)：用RT-PCR檢測(cè)某一特定基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。2.醫(yī)學(xué)(1)感染性疾病病原體的診斷：HIV、結(jié)核分枝桿菌、乙肝病毒等。(2)遺傳病相關(guān)基因的檢測(cè)：鐮刀型細(xì)胞貧血、血友病。(3)惡性腫瘤的診斷3.基因動(dòng)、植物的檢測(cè)(1)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的檢測(cè)：檢測(cè)某一基因的遺傳穩(wěn)定性。(2)轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)：玉米、大豆等。11PCR新技術(shù)RT-PCR：用于RNA分析梯度PCR：可用于找

5、出最適合的退火溫度反向PCR：可對(duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析不對(duì)稱PCR：用于制備單鏈DNA多重PCR：加上二對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段降落PCR：用于PCR條件的優(yōu)化，避免非特異性序列的擴(kuò)增實(shí)時(shí)定量PCR(RealTimeQuantitativePCR,qRT-PCR)巢式PCR：使用兩對(duì)（而非一對(duì)）PCR引物擴(kuò)增完整的片段12反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起，提供了一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。135’3’AAAAA5’3’5’3’3’5’5'3’3'5’5’3’RT-PCR

6、原理mRNA1stcDNA逆轉(zhuǎn)錄酶、下游引物、dNTPsTaqDNA聚合酶、上游及下游引物、dNTPs5’5’3’3’特異PCR產(chǎn)物5’5’3’3’經(jīng)30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)生230個(gè)分子拷貝5’5’3’3’14一步法RT-PCRRT反應(yīng)與PCR反應(yīng)在同一個(gè)試管中進(jìn)行。兩步法RT-PCRRT反應(yīng)與PCR反應(yīng)在不同的試管中進(jìn)行。下游引物特異性引物Oligo(dT)15降落PCR（TouchdownPCR）用來避免非特異性序列的擴(kuò)增PCR中引物的黏合溫度(annealingtemperature)決定了黏合的特異性，溫度越高特異性越強(qiáng)，但過高則不能實(shí)現(xiàn)引物

7、和模板的結(jié)合，而過低會(huì)產(chǎn)生大量非特異性產(chǎn)物。因此進(jìn)行PCR時(shí)需要尋找合適的黏合溫度。降落PCR開始先設(shè)定一個(gè)比較高的黏合溫度，每個(gè)循環(huán)黏合溫度下降1℃，到一個(gè)較低溫度以后每個(gè)循環(huán)的黏合溫度保持不變直到結(jié)束。在剛下降到特異性結(jié)合可以進(jìn)行的最高溫度時(shí)，可以達(dá)到最高的特異性。這樣在起初的幾個(gè)循環(huán)中，特異性擴(kuò)增序列可以相對(duì)非特異性序列多擴(kuò)增若干倍，從而減輕非特異性擴(kuò)增對(duì)結(jié)果的干擾。這種方法可用于省去多次試驗(yàn)最佳黏合溫度的工作。16反向PCR(InversePCR,IPCR)擴(kuò)增引物相反方向DNA序列的技術(shù)。用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的未知序列的

8、片段，而常規(guī)PCR擴(kuò)增的是已知序列的兩引物之間DNA片段.實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇已知序列內(nèi)部沒有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對(duì)該段DNA進(jìn)行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連