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《微生物實驗十七、 酵母rna的提取及組份鑒定.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、實驗七、微生物遺傳物質(zhì)提取、測序?qū)嶒炓?、實驗目?.了解并掌握稀堿法提取核酸的原理和方法。2.學習使用血球記數(shù)板測定微生物數(shù)量的方法。3.了解核酸的組分并掌握其鑒定方法。二、實驗原理核酸是一類不穩(wěn)定的生物大分了，在制備過程屮很容易發(fā)生降解。因此，要使制得的核酸盡可能保持其在生物體內(nèi)的夭然狀態(tài)，制備核酸必須采用溫和的條件。酵母核酸屮RNA含量較多，RNA達2.67-10.0%,而DNA含量僅為0.03-0.516%,酵母核酸的提取方法較多，工業(yè)上一般選用成木較低、適宜于大規(guī)模操作的稀堿法和濃鹽法。稀堿法是用1%NaOH溶液，將細胞壁溶解，用酸屮
2、和，升高溫度使蛋白質(zhì)變性，將蛋白質(zhì)與核酸分離，然后除去菌體，將pH調(diào)至RNA的等電點（PH2.5）,使核酸沉淀出來。稀堿法的優(yōu)點是抽提時間短，但核酸在此條件下不穩(wěn)定，容易分解。血球計數(shù)板法主要計數(shù)酵母、原生動物等個體較大的微生物，是計數(shù)一定容積屮的細胞總數(shù)的常用方法。其型號分為XB.K.25.和XB.K.16.兩種，前者是一個大方格分成25個屮方格，而每個屮方格又分成16個小方格；后者為一個大方格分成16個屮方格，而每個屮方格又分成25個小方格。但無論是哪一種規(guī)格的計數(shù)板，每一個大方格屮的小方格都是400個。每一個大方格邊長為1mm,則每一個
3、大方格的面積為1mn?，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之.間的高度為0」mm,所以計數(shù)室的容積為0.1mm3（刀分之一毫升）。核酸、核甘酸及其衍生物都具有共覘雙鍵系統(tǒng)，能吸收紫外光。RNA的紫外吸收高峰在0D260nm波長處。一般在0D260nm波長下，每毫升含1ugRNA溶液的吸光值為0.022。故測定未知濃度RNA溶液0D260nm波長的吸光值即可計算出其中核酸的含量。此法操作簡便，迅速。核糖核酸含有核糖、嚓吟堿、喘碇堿和磷酸等備纟R分，加入硫酸羔沸可使其水解，從水解液中可以測出上述組分的存在。磷酸與定磷試劑作用可以生成藍色的釦藍。核糖與地
4、衣酚試劑反應呈鮮綠色。脫氧核糖與二苯胺試劑反應生成藍色化合物，而核糖無此反應。嚓吟堿與硝酸銀反應能產(chǎn)生白色的嚓吩銀化合物沉淀。三、試劑和儀器設(shè)備1?材料與試劑酵母粉；0.（）4mol/LNaOH；酸性乙醇：將0.3mL濃鹽酸加入到30mL乙醇屮；95%乙醇；1.5mol/L硫酸；濃氨水；0.1mol/L硝酸銀。定磷試劑：17%硫酸：將17mL濃硫酸（比重1084）緩緩傾入83mL水屮；2.5%釦酸僅：2.5g釦酸錢溶于lOOmL水中；10%抗壞血酸溶液：l（）g抗壞血酸溶于1OOmL水，棕色并保存溶液；臨用時將三種溶液和水按下列比例混合：17
5、%硫酸：2.5%釦酸錢：10%抗壞血酸：水=1：1：1：2（V/V）o2?儀器250mL三角瓶；離心機；溫度計；研缽；分析天平；紫外分光光度計；恒溫水?。槐?。四、操作步1?稀堿法制備核酸（1）將10g干酵母懸浮于50mL0.04mol/LNa0H溶液屮，并在研缽屮研磨成漿狀。（2）將酵母漿轉(zhuǎn)入lOOmL三角瓶屮，置沸水浴屮加熱30min后冷卻。3000r/min離心15min。（3）上清液倒入20mL的酸性乙醇屮，邊攪拌邊傾入。（4）沉淀完全示，3000r/min離心lOmin。棄上清液。（5）用10mL95%乙醇洗滌沉淀,3000r/mi
6、n離心5min□重復洗滌一次。將沉淀轉(zhuǎn)入布氏漏斗中抽濾。得到濕RXA粗品。（6）用電了天平稱提取的濕RNA粗品的重量。2.RNA組份鑒定取2g提取的核酸，加1.5M硫酸10mL,沸水浴加熱10分鐘制成水解液，然后進行組份鑒定。（1）卩票吟堿：取水解液ImL加入過量濃氨水。然示加入lmLO.1M硝酸銀溶液，觀察有無11票吟堿銀化合物沉淀。（2）磷酸：取水解液ImL，加定磷試劑ImLo在水浴屮加熱觀察溶液是否變成藍色。（3）核糖：取水解液ImL,三氯化鐵濃鹽酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL0放沸水浴屮lOmino注意觀察核糖是否變成綠色。（
7、4）脫氧核糖的測定：測定脫氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脫氧核糖的DNA在酸性條件下合二苯胺在沸水浴屮共熱后，產(chǎn)生藍色。這是因為DNA喋吟核廿酸上的脫氧核糖遇酸生成3-拜基-6-酮基戊醛，再與二苯胺作用產(chǎn)生藍色物質(zhì)。DNA+少量濃硫酸或冰乙酸+二苯胺一藍色物質(zhì)。注意：DNA、蛋白質(zhì)和粘多糖等物質(zhì)對測定有干擾作用。五、實驗數(shù)據(jù)及其處理（1）記錄稀堿法提取RNA質(zhì)量，計算提取率。（2）記錄每克活性干酵母所含酵母數(shù)。六、思考題1.為什么用稀堿溶液可以使酵母細胞裂解？2.如何從酵母屮提取到較純的RNA?
