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1、論文題目：小型豬牙齒相關(guān)干細(xì)胞介導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性牙周炎骨缺損修復(fù)及生物牙根再生體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究作者簡(jiǎn)介：劉怡，女，1972年9月出生，2003年8月師從于首都醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院王松靈教授，于2006年6月獲博士學(xué)位中文摘要牙周炎很常見(jiàn)，常引起牙周骨缺損，是導(dǎo)致牙齒缺失的主要原因之一。目前臨床上牙周炎致骨缺損的治療是一個(gè)難題。牙齒缺失也很常見(jiàn)，目前臨床上均是贗復(fù)體修復(fù)，缺乏真正意義上的生物修復(fù)。牙齒相關(guān)干細(xì)胞及組織工程技術(shù)為新的生物性修復(fù)再生牙周組織及其牙齒提供了可能。本研究利用與人類牙頜系統(tǒng)相似的小型豬作為大型動(dòng)物模型，首先分離培養(yǎng)小
2、型豬牙周膜干細(xì)胞及根尖牙乳頭干細(xì)胞，研究其生物學(xué)特性，并建立穩(wěn)定可靠的牙周炎骨缺損模型，探討牙周膜干細(xì)胞修復(fù)實(shí)驗(yàn)性牙周炎骨缺損的能力；同時(shí)利用牙周膜干細(xì)胞及根尖牙乳頭干細(xì)胞復(fù)合生物支架材料進(jìn)行生物牙根再生。本研究旨在為利用牙齒相關(guān)干細(xì)胞結(jié)合組織工程技術(shù)進(jìn)行牙周再生修復(fù)及生物性牙齒再生修復(fù)提供大型動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究包括以下三部分。第一部分小型豬牙周膜干細(xì)胞及根尖牙乳頭干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究目的：分離培養(yǎng)小型豬牙周膜干細(xì)胞及根尖牙乳頭干細(xì)胞，研究其生物學(xué)特性，為利用干細(xì)胞進(jìn)行牙周及牙根組織工程打下基礎(chǔ)。方法：選取
3、3只成年小型豬，無(wú)菌條件下拔除尖牙，剝離牙根外牙周組織及根尖牙乳頭組織，參照以往關(guān)于人牙齒相關(guān)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法及條件分離培養(yǎng)小型豬牙周膜干細(xì)胞及根尖牙乳頭干細(xì)胞，并通過(guò)倒置顯微鏡、免疫組織化學(xué)、免疫熒光、流式細(xì)胞儀、透射電鏡、掃描電鏡等對(duì)其生長(zhǎng)特性及在三維支架材料羥基磷灰石/磷酸三鈣（HA/TCP）上的生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察。結(jié)果：原代培養(yǎng)的小型豬牙周膜干細(xì)胞生長(zhǎng)良好，呈多角形或梭性，克隆形成率為1～23個(gè)/105，根尖牙乳頭干細(xì)胞克隆形成率為20～130個(gè)/105。免疫熒光結(jié)果表明，分離培養(yǎng)的第3代牙周膜干細(xì)胞中部分細(xì)胞Stro
4、-1、Nestin及ALP表達(dá)陽(yáng)性，流式細(xì)胞儀結(jié)果表明牙周膜干細(xì)胞Stro-1表達(dá)陽(yáng)性率為5.6%，Nestin為12.5%，ALP為15.0%。根尖牙乳頭干細(xì)胞中約有7.6%的細(xì)胞抗Stro-1抗體陽(yáng)性。第2代牙周膜干細(xì)胞及根尖牙乳頭干細(xì)胞的倍增時(shí)間最快，生長(zhǎng)曲線呈“S”型。透射電鏡下可見(jiàn)，第1～3代牙周膜干細(xì)胞及根尖牙乳頭干細(xì)胞生長(zhǎng)良好，胞漿內(nèi)線粒體、高爾基體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，分泌的細(xì)胞外基質(zhì)增多。并且牙周膜干細(xì)胞分泌的膠原纖維比相同條件下培養(yǎng)的根尖牙乳頭干細(xì)胞更多，更厚。掃描電鏡觀察結(jié)果表明，牙周膜
5、干細(xì)胞及根尖牙乳頭干細(xì)胞在HA/TCP三維支架上生長(zhǎng)良好，充分伸展，并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)。結(jié)論：小型豬牙周膜干細(xì)胞及根尖牙乳頭干細(xì)胞可被成功的分離培養(yǎng)，在體外表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，有望為牙周組織再生和生物牙根再生提供有用的細(xì)胞來(lái)源。本部分研究?jī)?nèi)容在JournalofEndodontics發(fā)表論文兩篇（2008,34(2):166-171；2008,34(6):645-651）。第二部分牙周膜干細(xì)胞介導(dǎo)修復(fù)實(shí)驗(yàn)性牙周炎骨缺損的小型豬體內(nèi)研究目的：建立穩(wěn)定可靠的牙周炎模型，探討利用牙周膜干細(xì)胞在小型豬體內(nèi)修復(fù)實(shí)驗(yàn)性牙周炎骨缺損的
6、可行性。方法：采用4種骨缺損加結(jié)扎絲線的方法建立小型豬實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型，分別在術(shù)后4周、12周和16周進(jìn)行臨床指標(biāo)（菌斑指數(shù)、齦溝出血指數(shù)、牙周探診深度、附著喪失）和影像學(xué)觀察，確定可靠的建立牙周炎骨缺損模型的方法。用分離培養(yǎng)的第3代牙周膜干細(xì)胞與HA/TCP混合后回植于小型豬實(shí)驗(yàn)性牙周炎骨缺損部位。用臨床指標(biāo)、影像學(xué)及組織病理學(xué)結(jié)果評(píng)價(jià)牙周組織修復(fù)效果。同時(shí)，為了追蹤回植牙周膜干細(xì)胞在小型豬體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸，在體外采用RV-GFP標(biāo)記牙周膜干細(xì)胞，回植于小型豬牙周炎骨缺損處，回植12周后取標(biāo)本作硬組織切片，熒光顯微鏡下觀察GFP
7、陽(yáng)性牙周膜干細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸。結(jié)果：本研究所采用的骨缺損加結(jié)扎絲線的方法可形成穩(wěn)定的小型豬實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型。各組在實(shí)驗(yàn)前和建模后牙周狀況基本相似，基線可比。治療12周后，牙周膜干細(xì)胞組附著喪失為3.3+0.6mm，HA/TCP組為5.3+0.3mm，對(duì)照組為6.3+0.5mm,單因素方差分析結(jié)果表明,附著喪失在三組有顯著性差異（P<0.01）。兩兩比較結(jié)果表明，牙周膜干細(xì)胞組與HA/TCP組,牙周膜干細(xì)胞組與對(duì)照組，HA/TCP組與對(duì)照組間均有顯著性差異（均為P=0.000）。CT薄層冠狀掃描圖顯示治療12周后，牙周膜干細(xì)胞組有明
8、顯的新生骨質(zhì)影像，而HA/TCP組和對(duì)照組的骨再生不明顯。正常牙周組織中，結(jié)合上皮位于釉牙骨質(zhì)界處,牙槽嵴頂位于釉牙骨質(zhì)界下約2mm，齦溝上皮由扁平的復(fù)層上皮組成，上皮下結(jié)締組織內(nèi)沒(méi)有明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),牙周膜間隙窄，Sharpey’s纖維是牙周膜內(nèi)的典型結(jié)構(gòu)。治療12周后,牙周膜干細(xì)胞組結(jié)
