論文題目小型豬牙齒相關干細胞介導的實驗性牙周炎骨缺

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1、論文題目：小型豬牙齒相關干細胞介導的實驗性牙周炎骨缺損修復及生物牙根再生體內實驗研究作者簡介：劉怡，女，1972年9月出生，2003年8月師從于首都醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院王松靈教授，于2006年6月獲博士學位中文摘要牙周炎很常見，常引起牙周骨缺損，是導致牙齒缺失的主要原因之一。目前臨床上牙周炎致骨缺損的治療是一個難題。牙齒缺失也很常見，目前臨床上均是贗復體修復，缺乏真正意義上的生物修復。牙齒相關干細胞及組織工程技術為新的生物性修復再生牙周組織及其牙齒提供了可能。本研究利用與人類牙頜系統(tǒng)相似的小型豬作為大型動物模型，首先分離培養(yǎng)小型豬牙周膜干細胞及根尖牙乳頭干細胞，研究其生物學特性，并建立穩(wěn)定可

2、靠的牙周炎骨缺損模型，探討牙周膜干細胞修復實驗性牙周炎骨缺損的能力；同時利用牙周膜干細胞及根尖牙乳頭干細胞復合生物支架材料進行生物牙根再生。本研究旨在為利用牙齒相關干細胞結合組織工程技術進行牙周再生修復及生物性牙齒再生修復提供大型動物的實驗依據。本研究包括以下三部分。第一部分小型豬牙周膜干細胞及根尖牙乳頭干細胞體外分離培養(yǎng)及生物學特性研究目的：分離培養(yǎng)小型豬牙周膜干細胞及根尖牙乳頭干細胞，研究其生物學特性，為利用干細胞進行牙周及牙根組織工程打下基礎。方法：選取3只成年小型豬，無菌條件下拔除尖牙，剝離牙根外牙周組織及根尖牙乳頭組織，參照以往關于人牙齒相關干細胞的培養(yǎng)方法及條件分離培養(yǎng)小型豬牙

3、周膜干細胞及根尖牙乳頭干細胞，并通過倒置顯微鏡、免疫組織化學、免疫熒光、流式細胞儀、透射電鏡、掃描電鏡等對其生長特性及在三維支架材料羥基磷灰石/磷酸三鈣（HA/TCP）上的生長情況進行觀察。結果：原代培養(yǎng)的小型豬牙周膜干細胞生長良好，呈多角形或梭性，克隆形成率為1～23個/105，根尖牙乳頭干細胞克隆形成率為20～130個/10510。免疫熒光結果表明，分離培養(yǎng)的第3代牙周膜干細胞中部分細胞Stro-1、Nestin及ALP表達陽性，流式細胞儀結果表明牙周膜干細胞Stro-1表達陽性率為5.6%，Nestin為12.5%，ALP為15.0%。根尖牙乳頭干細胞中約有7.6%的細胞抗Stro-

4、1抗體陽性。第2代牙周膜干細胞及根尖牙乳頭干細胞的倍增時間最快，生長曲線呈“S”型。透射電鏡下可見，第1～3代牙周膜干細胞及根尖牙乳頭干細胞生長良好，胞漿內線粒體、高爾基體和粗面內質網豐富，隨著培養(yǎng)時間的延長，分泌的細胞外基質增多。并且牙周膜干細胞分泌的膠原纖維比相同條件下培養(yǎng)的根尖牙乳頭干細胞更多，更厚。掃描電鏡觀察結果表明，牙周膜干細胞及根尖牙乳頭干細胞在HA/TCP三維支架上生長良好，充分伸展，并分泌大量細胞外基質。結論：小型豬牙周膜干細胞及根尖牙乳頭干細胞可被成功的分離培養(yǎng)，在體外表現(xiàn)出良好的生長狀態(tài)，有望為牙周組織再生和生物牙根再生提供有用的細胞來源。本部分研究內容在Journa

5、lofEndodontics發(fā)表論文兩篇（2008,34(2):166-171；2008,34(6):645-651）。第二部分牙周膜干細胞介導修復實驗性牙周炎骨缺損的小型豬體內研究目的：建立穩(wěn)定可靠的牙周炎模型，探討利用牙周膜干細胞在小型豬體內修復實驗性牙周炎骨缺損的可行性。方法：采用4種骨缺損加結扎絲線的方法建立小型豬實驗性牙周炎模型，分別在術后4周、12周和16周進行臨床指標（菌斑指數(shù)、齦溝出血指數(shù)、牙周探診深度、附著喪失）和影像學觀察，確定可靠的建立牙周炎骨缺損模型的方法。用分離培養(yǎng)的第3代牙周膜干細胞與HA/TCP混合后回植于小型豬實驗性牙周炎骨缺損部位。用臨床指標、影像學及組織

6、病理學結果評價牙周組織修復效果。同時，為了追蹤回植牙周膜干細胞在小型豬體內的轉歸，在體外采用RV-GFP標記牙周膜干細胞，回植于小型豬牙周炎骨缺損處，回植12周后取標本作硬組織切片，熒光顯微鏡下觀察GFP陽性牙周膜干細胞的轉歸。結果：本研究所采用的骨缺損加結扎絲線的方法可形成穩(wěn)定的小型豬實驗性牙周炎模型。各組在實驗前和建模后牙周狀況基本相似，基線可比。治療12周后，牙周膜干細胞組附著喪失為3.3+0.6mm，HA/TCP組為5.3+0.3mm，對照組為6.3+0.5mm,單因素方差分析結果表明,附著喪失在三組有顯著性差異（P<0.01）。兩兩比較結果表明，牙周膜干細胞組與HA/TCP組,1

7、0牙周膜干細胞組與對照組，HA/TCP組與對照組間均有顯著性差異（均為P=0.000）。CT薄層冠狀掃描圖顯示治療12周后，牙周膜干細胞組有明顯的新生骨質影像，而HA/TCP組和對照組的骨再生不明顯。正常牙周組織中，結合上皮位于釉牙骨質界處,牙槽嵴頂位于釉牙骨質界下約2mm，齦溝上皮由扁平的復層上皮組成，上皮下結締組織內沒有明顯炎癥細胞浸潤,牙周膜間隙窄，Sharpey’s纖維是牙周膜內的典型結構。治療12周后,牙周膜干