硫酸苯酚法與硫酸蒽酮法測多糖.doc

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1、硫酸苯酚法與硫酸蒽酮法測多糖植物體內(nèi)的碳素營養(yǎng)狀況以及農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)性狀，常以可溶性糖和淀粉的含量作為重要指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)幾種定量測定可溶性糖和淀粉的方法。（一）苯酚法測定可溶性糖【實(shí)驗(yàn)原理】植物體內(nèi)的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的單糖和寡聚糖。苯酚法測定可溶性糖的原理是：糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10－100mg范圍內(nèi)其顏色深淺與糖的含量成正比，且在485nm波長下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長下測定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測定，方法簡單，靈敏度高，實(shí)驗(yàn)時基本不受蛋白質(zhì)

2、存在的影響，并且產(chǎn)生的顏色穩(wěn)定160min以上?！緦?shí)驗(yàn)儀器及試劑】1．儀器：分光光度計(jì)、電爐、鋁鍋、20mL刻度試管、刻度吸管、記號筆、吸水紙適量。2．試劑：（1）90％苯酚溶液：稱取90g苯酚（AR），加蒸餾水10mL溶解，在室溫下可保存數(shù)月。（2）9％苯酚溶液：取3mL90％苯酚溶液，加蒸餾水至30mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。（3）濃硫酸（比重1.84）。（4）1％蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液：將分析純蔗糖在80℃下烘至恒重，精確稱取1.000g。加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL濃硫酸，用蒸餾水定容至刻度。（5）100ug/L蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液：精確吸取1

3、％蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液1mL加入100mL容量瓶中，加水定容?！緦?shí)驗(yàn)步驟】1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取20mL刻度試管11支，從0－10分別編號，按表27－1加入溶液和水，然后按順序向試管內(nèi)加入1mL9％苯酚溶液，搖勻，再從管液正面以5－20s。加入5mL濃硫酸，搖勻。比色液總體積為8mL，在恒溫下放置30min。顯色。然后以空白為參比，在485nm波長下比色測定，以糖含量為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出標(biāo)準(zhǔn)直線方程。2．可溶性糖的提取取新鮮植物葉片，擦凈表面污物，剪碎混勻，稱取0.10－0.30g，共3份，分別放入3支刻度試管中，加入5-10m

4、L蒸餾水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液過濾入25mL容量瓶中，反復(fù)沖洗試管及殘?jiān)ㄈ葜量潭取?．測定吸取0.5mL樣品液于試管中（重復(fù)2次），加蒸餾水1.5mL，同制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟，按順序分別加入苯酚、濃硫酸溶液，顯色并測定光密度。由標(biāo)準(zhǔn)線性方程求出糖的量，按下式計(jì)算測試樣品中糖含量。式中：C一標(biāo)準(zhǔn)方程求得糖量（ug）α一吸取樣品液體積（mL）V－提取液量（mL）n一稀釋倍數(shù)W一組織重量（g）（二）蒽酮法測定可溶性糖【實(shí)驗(yàn)原理】糖在濃硫酸作用下，可經(jīng)脫水反應(yīng)生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反

5、應(yīng)生成藍(lán)綠色糠醛衍生物，在一定范圍內(nèi)，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用于糖的定量。該法的特點(diǎn)是幾乎可以測定所有的碳水化合物，不但可以測定戊糖與己糖，而且可以測所有寡糖類和多糖類，其中包括淀粉、纖維素等（因?yàn)榉磻?yīng)液中的濃硫酸可以把多糖水解成單糖而發(fā)生反應(yīng)X所以用愈酮法測出的碳水化合物含量，實(shí)際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。在沒有必要細(xì)致劃分各種碳水化合物的情況下，用意酮法可以一次測出總量，省去許多麻煩，因此，有特殊的應(yīng)用價(jià)值。但在測定水溶性碳水化合物時，則應(yīng)注意切勿將樣品的未溶解殘?jiān)尤敕磻?yīng)液中，不然會因?yàn)榧?xì)胞壁中的纖維素、半纖維素等與

6、意酮試劑發(fā)生反應(yīng)而增加了測定誤差。此外，不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺，故測定糖的混合物時，常因不同糖類的比例不同造成誤差，但測定單一糖類時，則可避免此種誤差。糖類與蒽酮反應(yīng)生成的有色物質(zhì)在可見光區(qū)的吸收峰為630nm，故在此波長下進(jìn)行比色。【實(shí)驗(yàn)儀器及試劑】1．儀器：分光光度計(jì)、電爐、鋁鍋、20ml刻度試管、刻度吸管、記號筆、吸水紙適量。2．試劑：（1）蒽酮乙酸乙酯試劑：取分析純蒽酮1g，溶于50mL乙酸乙酯中，貯于棕色瓶中，在黑暗中可保存數(shù)周，如有結(jié)晶析出，可微熱溶解。（2

7、）濃硫酸（比重1.84）【實(shí)驗(yàn)步驟】1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：按方法一標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法加入標(biāo)準(zhǔn)的蔗糖溶液，然后按順序向試管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯試劑和5mL濃硫酸，充分振蕩，立即將試管放入沸水浴中，逐管準(zhǔn)確保溫1min取出后自然冷卻至室溫，以空白作參比，在630nm波長下測其光密度，以光密度為縱坐標(biāo)，以糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出標(biāo)準(zhǔn)線性方程。2．可溶性糖的提取同方法一第二步。3．顯色測定：吸取樣品提取液0.5mL于20mL刻度試管中（重復(fù)2次），加蒸餾水1.5mL，以下步驟與標(biāo)準(zhǔn)曲線測定相同，測定樣品的光密度。4．計(jì)算可溶性糖的含

8、量，計(jì)算公式同方法一。