苯酚硫酸法測總糖

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1、苯酚-硫酸法苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物。再以比色法測定。[試劑]6%苯酚：先配置80%苯酚：80g苯酚（分析純重蒸餾試劑）加20g水使之溶解，可置冰箱中避光長期儲(chǔ)存。再配置6%苯酚：取75ul的80%苯酚于燒杯中，加入960ul水（每次測定均需現(xiàn)配），測定的時(shí)候就用6%的苯酚來測！濃硫酸[操作]1．制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸餾水補(bǔ)至2.0ml，然后加入6%苯酚

2、1.0ml及濃硫酸5.0ml,搖勻冷卻，室溫放置20分鐘以后于490nm測光密度，以2.0ml水按同樣顯色操作為空白，橫坐標(biāo)為多糖微克數(shù)，縱坐標(biāo)為光密度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。2．樣品含量測定：吸取2.0ml樣品，然后加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml,搖勻冷卻室溫放置30分鐘以后于490nm測光密度。每次測定取雙樣對照。以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。可能有以下問題需要注意:1。苯酚是否重蒸、其溶液濃度、是否現(xiàn)配現(xiàn)用2。加入硫酸后是否加熱、顯色時(shí)間的確定3。閣下所選波長：這個(gè)最為重要，因?yàn)橐烟羌捌浼谆苌镌?90nm下有最大吸收峰，而戊糖、糠醛酸及其甲基化衍生物在480nm下有

3、最大吸收峰。如果閣下的多糖樣品不是單一品而是數(shù)種混合（純化也難一達(dá)到100%純），則波長一定要掃描過再做4。加濃硫酸前要搖勻，加之后也要搖勻。苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物。再以比色法測定。原理　　多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物。再以比色法測定。試劑　　1．濃硫酸：分析純，95.5%　　2．80%苯酚：80克苯酚（分析純重蒸餾試劑）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光長期儲(chǔ)存?！　?．6%苯酚：臨用前以80%苯酚配制。（每次測定均需現(xiàn)配）　　4．標(biāo)準(zhǔn)葡

4、聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析純葡萄糖?！　?．15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中長期儲(chǔ)存?！　?．5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中長期儲(chǔ)存?！　?．6mol/L氫氧化鈉：120克分析純氫氧化鈉溶于500ml水?！　?．6mol/L鹽酸操作　　1．制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸餾水補(bǔ)至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0

5、ml,搖勻冷卻，室溫放置20分鐘以后于490nm測光密度，以2.0ml水按同樣顯色操作為空白，橫坐標(biāo)為多糖微克數(shù)，縱坐標(biāo)為光密度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線?！　?．樣品含量測定：　?、偃悠?克（濕樣）加1ml15%TCA溶液研磨，再加少許5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升離心管中，再加少許5％TCA溶液研磨，倒上清液，重復(fù)3次。最后一次將殘?jiān)黄鸬饺腚x心管。注意：總的溶液不要超出10毫升。（既不要超出離心管的容量）?！　、陔x心，轉(zhuǎn)速3000轉(zhuǎn)/分鐘，共三次。第一次15分鐘，取上清液。后兩次各5分鐘取上清液到25毫升錐形比色管中。最后濾液保持18毫升左右。（測肝胰腺樣品時(shí)，每次取上

6、清液時(shí)應(yīng)過濾。因?yàn)槠渲竞看笕菀讑A帶殘?jiān)＃　、鬯?，在向比色管中加?毫升6mol/L鹽酸之后搖勻，在96℃水浴鍋中水浴2小時(shí)?！　、芏ㄈ萑?。水浴后，用流水冷卻后加入2毫升6mol/L氫氧化鈉搖勻。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2ml的樣品液，以蒸餾補(bǔ)至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml,搖勻冷卻室溫放置20分鐘以后于490nm測光密度。每次測定取雙樣對照。以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。注意　　（1）此法簡單、快速、靈敏、重復(fù)性好，對每種糖僅制作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，顏色持久?！　。?）制作標(biāo)準(zhǔn)線宜用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)多糖，如用葡萄糖，應(yīng)以校正系數(shù)0.9校正μg

7、數(shù)?！　。?）對雜多糖，分析結(jié)果可根據(jù)各單糖的組成比及主要組分單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線的校正系數(shù)加以校正計(jì)算?！　。?）測定時(shí)根據(jù)光密度值確定取樣的量。光密度值最好在0.1——0.3之間。比如：小于0.1之下可以考慮取樣品時(shí)取2克，仍取0.2ml樣品液，如大于0.3可以減半取0.1ml的樣品液測定。