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1、實(shí)驗(yàn)一、硫酸苯酚法測(cè)多糖含量精品文檔實(shí)驗(yàn)一硫酸－苯酚法測(cè)多糖含量1．目的要求
???測(cè)量蒽酮硫酸法不能測(cè)量的血清型的過(guò)程樣品中的多糖含量
2．方法原理
糖在濃硫酸作用下，水解生成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚縮合成橙黃色化合物，且顏色穩(wěn)定，在波長(zhǎng)490nm處和一定的濃度范圍內(nèi)，其吸光度與多糖含量呈線性關(guān)系正比，從而可以利用分光度計(jì)測(cè)定其吸光度，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測(cè)定樣品的多糖含量，本方法可用于多糖、單糖含量的測(cè)定。
3．主要實(shí)驗(yàn)儀器及材料
????濃硫酸，苯酚，蒸餾裝置，分光光度計(jì)，電子天平，坐標(biāo)紙或電腦等。
４．掌握要點(diǎn)
??硫酸顯色的安全、準(zhǔn)確操作，單
2、糖到多糖的轉(zhuǎn)換系數(shù)。
５．試劑配制
1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制
準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥恒重的葡萄糖100mg，蒸餾水準(zhǔn)確定容至100mL的1mg/L的葡萄糖液，搖勻后準(zhǔn)確吸取10mL該溶液，蒸餾水稀釋定容至100mL,即得100ug/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。
2）90%苯酚液的配制
??準(zhǔn)確移取苯酚90mL，蒸餾水定容至100mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存3）6%苯酚液的配制將90%苯酚液稀釋至6%，即一體積儲(chǔ)存液對(duì)應(yīng)十四體積純水，臨用現(xiàn)配。6.實(shí)驗(yàn)步驟表1?標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作步驟
管號(hào)??????0?????????1??????2??????3???????4???????5
3、??????6?????7
葡萄糖?0.0?????0.1???0.2???0.3????0.4???0.6??0.8?1.0
苯酚液?0.5????0.5???0.5???0.5????0.5???0.5???0.5??0.5
濃硫酸?3.0????3.0???3.0???3.0????3.0???3.0???3.0??3.0
取8支干凈的具塞試管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震蕩搖勻后緩慢逐滴加入純硫酸，以不放熱或微量放熱為宜，搖勻后恒溫加塞沸水放置20min,取出涼水冷卻10min,以0號(hào)作為空白調(diào)零,在最大吸收波長(zhǎng)處（490nm）測(cè)定
4、吸光度。以葡萄糖濃度X為橫坐標(biāo)（ug/mL），吸光度Y為縱坐標(biāo)，從而來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用exceL軟件求得回歸方程
2收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系管理員刪除精品文檔）待測(cè)樣品多糖的測(cè)定與計(jì)算
將提取得到的待測(cè)多糖用蒸餾水溶解，定容至100mL,取溶解后的溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線中的測(cè)定方法，以樣液為參比液，測(cè)定溶液的吸光值，按回歸方程計(jì)算待測(cè)溶液的多糖濃度，注意乘換算系數(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理游離的己糖或多糖中的己糖基、戊糠醛及己糖醛酸在濃硫酸的作用下脫水生成糠醛衍生物，糠醛衍生物與蒽酮縮合成藍(lán)色的化合物，在620nm處有最大吸收，在一定糖濃度范圍內(nèi)（200ug/ml），溶液吸光度值與糖
5、溶液的濃度成線性關(guān)系。用酸將植物組織中沒(méi)有還原性的多糖和寡糖徹底水解成具有還原性的單糖，或直接提取植物組織中的還原糖，即可對(duì)植物組織中的總糖和還原糖進(jìn)行定量測(cè)定。三、實(shí)驗(yàn)材料1．可見(jiàn)分光光度計(jì)、電子天平(1/100)、粉碎機(jī)、水浴鍋、電爐。研缽、量筒、三角燒瓶、燒杯、容量瓶、玻璃漏斗、試管1.5cm×15cm、刻度吸管、膠頭滴管、pH試紙、坐標(biāo)紙。四、實(shí)驗(yàn)試劑1．蒽酮試劑：取2g蒽酮溶于l000ml體積分?jǐn)?shù)為80％的硫酸中，當(dāng)日配制使用。2．標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液(0.1mg-m1)：稱(chēng)取100mg葡萄糖，溶于蒸餾水并稀釋至1000ml（可滴加幾滴甲苯作防腐劑）。3．6mol
6、-LHCl溶液：50ml鹽酸，加水至100ml。4．10％NaOH溶液：稱(chēng)取10gNaOH固體，溶于蒸餾水并稀釋至100ml。五、操作步驟1．葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取干凈試管6支，按下表進(jìn)行操作。以吸光度為縱坐標(biāo)各標(biāo)準(zhǔn)液濃度(mg-m1)為橫坐標(biāo)做圖。2．樣品中還原糖的提取和測(cè)定稱(chēng)取植物原料干粉0.1～0.5g，加水約3ml，在研缽中磨成勻漿，轉(zhuǎn)入三角燒瓶中，并用約30ml的蒸餾水沖洗研缽2～3次，洗出液也轉(zhuǎn)入三角燒瓶中。于50℃水浴中保溫半小時(shí)（使還原糖浸出），取出，冷卻后定容至100ml。過(guò)濾，取lml濾液進(jìn)行還原糖的測(cè)定：吸取lml總糖類(lèi)溶液置試管中，浸于冰浴中冷
7、卻，再加入4ml蒽酮試劑，沸水浴中準(zhǔn)確加熱10min，取出用自來(lái)水冷卻后比色，其他條件與做標(biāo)準(zhǔn)曲線相同，測(cè)得的吸光度值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查算出樣品液的糖含量。（樣品液顯色后若顏色很深，其吸光度超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍，則應(yīng)將樣品提取液適當(dāng)稀釋后再加蒽酮顯色測(cè)定）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及樣品測(cè)定參考表1#2#3#4#5#6#7#（樣品）8#（樣品）收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系管理員刪除精品文檔標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液(ml)00.20.40.60.81.0還原糖總糖蒸餾水(ml)1.00.80.60.40.20樣品液(ml)------1.01.0糖溶液濃度(mg/ml)00.02
