農桿菌介導的CaRLK基因轉化番茄的研究.pdf

《農桿菌介導的CaRLK基因轉化番茄的研究.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在工程資料-天天文庫。

1、萬方數(shù)據Agrobacterium——MediatedtransformationofC舭KGeneintoTomatoThesissubmittedtoOj'ngdaoAg，icultureUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofScienceWangJinlu(CollegeofLifeSciences)Supervisor：ZhaoMeiaiQingdao．ChinaJune．2012萬方數(shù)據學位論文獨創(chuàng)性聲明

2、IUlIIIIIlUIIY2663366本人聲明所呈交的學位論文是本人

3、在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經發(fā)表或撰寫過的研究成果。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。如不實，本人負全部責任。學位論文作者簽名：王金泵簽字日期：加垃年7月z日學位論文版權使用授權書本學位論文作者完全了解學校有關保留、使用學位論文的規(guī)定，有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權學?？梢詫W位論文的全部或部分內容編入有關數(shù)據庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。(保密的學位論

4、文在解密后適用本授權書)學位論文作者簽名：王金隸導師簽字：簽字日期：如f)年7月二日簽字日期：切，上年夕月齟萬方數(shù)據青島農業(yè)大學碩士學位論文摘要農桿菌介導的CaRLK基因轉化番茄的研究摘要番h$(LycopersiconesculentumMill)是一種世界性農作物，但番茄抗逆性差、易感病蟲害，尤其是細菌性青枯病，嚴重影響其產量和質量。本研究目的是利用農桿菌介導法將CaRLK基因轉入番茄抗線蟲自交系P88中，獲得轉基因植株，為篩選出具有多重抗性的轉基因番茄新品系奠定基礎。主要研究結果如下：1、優(yōu)化了農桿菌介導的番茄遺傳轉化體系，獲得了陽性轉基因植株。以生長8．10天

5、的生長健壯的P88幼苗的子葉、下胚軸為外植體，對番茄遺傳轉化條件進行了研究。對適宜的Hyg濃度進行篩選試驗(設計0，2，5，10，15，20mg／L)，最終確定Hyg的篩選壓為5mg／L。研究了不同預培養(yǎng)時間(0，12，24h)、侵染時間(5，10，15，20min)、共培養(yǎng)時間(O，1，2，3d)對遺傳轉化的影響。結果表明，外植體在預培養(yǎng)培養(yǎng)基(液體MS+10mg／LZT)上預培養(yǎng)12d，在農桿菌中侵染15min，共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+2．Omg／LZT+O．2mg／LI從)上共培養(yǎng)2d，然后轉移到篩選培養(yǎng)基(MS+2．Omg／LZT+O．2mg／LIAA+5．0mg

6、／LHyg+250mg／LCef)中進行篩選培養(yǎng)，為最佳的遺傳轉化條件。經PCI乙良應，擴增出了529bp特異性片段，即獲得了P88的轉基因植株。將獲得的9株轉基因植株，馴化培養(yǎng)后獲得轉基因種子，轉化率為15．5％。2、T】代轉基因植株形態(tài)學分析及分子生物學檢測馴化移栽T，代植株，對其進行形態(tài)學分析。研究結果發(fā)現(xiàn)：轉基因番茄植株在生長過程中表現(xiàn)出與普通植株不同的性狀，如：轉基因植株葉片變小、主莖與側莖之間夾角小于45。等，這種夾角變小的現(xiàn)象可能是由于外源基因的導入造成的。不論初生葉型大小，番茄植株長大以后恢復正常。轉基因果實與普通果實形態(tài)上沒有差異。利用改良的CTAB

7、法，提取T1代植株DNA進行PCR擴增；利用Trizol試劑提取Tl代植株RNA，對其進行RT．PCR反應。結果表明：T1代植株PCR擴增后擴增出與目的基因大小片段相同529bp的條帶，這表明該基因穩(wěn)定的遺傳給T1代；對T1代植株進行RT．PCR,結果發(fā)現(xiàn)，只有2號植株出現(xiàn)與目的基因片段大小相同的條帶，這說明該基因已轉入2號植物體內并表達。3、T2代轉基因植株形態(tài)學分析分子、生物學分析及功能驗證馴化移栽T2代植株，對其進行形態(tài)學分析。T2代植株同樣表現(xiàn)出與T1代相類似的現(xiàn)象，尤其是主莖與側莖之問夾角小于45。，這可能是由于CaRLK基因作為外源基因隨機的整合到受體染色

8、體上，造成表型的變化。萬方數(shù)據青島農業(yè)大學碩士學位論文摘要提取T2代植株的DNA進行PCR反應。結果表明：T2代植株PCR擴增出與目的基因相同的大小529bp的條帶，說明T2代植株已經穩(wěn)定遺傳了該基因；將T2代植株幼苗和普通幼苗移入不同濃度(50、100、150、200mmol／L)NaCl的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察其生長及生根情況。結果表明：轉基因植株在不同濃度下生長狀況較對照要好，根系較對照也發(fā)達；野生型植株生長緩慢、根系生長發(fā)育遲緩。轉基因植株在200mmol／LNaCl時為最適耐鹽濃度。4、T3代種子的獲得經T1代、T2代分子生物學鑒定及功能驗