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《臨床醫(yī)學(xué)畢業(yè)論文異種vegf融合蛋白疫苗對小鼠lewis肺癌的抑制作用.doc》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、XX大學(xué)畢業(yè)論文異種VEGF融合蛋白疫苗對小鼠Lewis肺癌的抑制作用2014年6月25日異種VEGF融合蛋白疫苗對小鼠Lewis肺癌的抑制作用作者：劉倩，唐亮，李英輝，周彩存，談立松，趙玉軍，張培德，張尚權(quán)【摘要】H的：利用原核表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建異源血管內(nèi)皮生長因子融合蛋白疫苗，研究該融合蛋白疫苗對小鼠Lewis肺癌腫瘤模型的抗血管牛成主動免疫治療效果。方法：將雞VEGF基因克隆入pGEX-4T-2原核表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，Ni-NTA純化，透析復(fù)性，構(gòu)建GST-cVEGF融合蛋白疫苗。將C57BL16J小鼠隨
2、機(jī)分為3組,GST?cVEGF疫苗組10只、cVEGF疫苗組10只、生理鹽水組(NS)10只。將各組樣品與等體積弗氏佐劑混合，各組小鼠每只分別0、2、3周免疫100ggGST-cVEGF融合蛋白疫苗、單純cVEGF蛋白疫苗、生理鹽水。接種Lewis肺癌細(xì)胞，觀察腫瘤的生長情況和小鼠狀態(tài)。接種腫瘤18d后，處死小鼠，剝離腫瘤稱重。檢測小鼠血清屮特異性抗VEGF抗體滴度。結(jié)果:GST-cVEGF疫苗組、cVEGF組、生理鹽水組腫瘤均重分別為(1.55±0.534)g、(1.93±0.607)g>(2.87±0.642)goGST
3、-cVEGF疫苗組腫瘤重量明顯小于生理鹽水組(P0.01)。疫苗組血清產(chǎn)生抗VEGF抗體滴度為1：2000o結(jié)論：異種血管內(nèi)皮生長因子基因重組融合蛋白疫苗可干擾機(jī)體對自身VEGF的免疫耐受，可產(chǎn)生較高水平的特異性抗VEGF抗體，并具有抑制小鼠Lewis腫瘤生長的效應(yīng)?！娟P(guān)鍵詞】血管內(nèi)皮生長因子融合蛋白疫苗腫瘤/免疫治療小鼠腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及其預(yù)后依賴于血管生成。血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothdialgrowthfactor,VEGF)^迄今發(fā)現(xiàn)最重要的血管生成因子Z—[1]。近年來以VEGF及其受體(vasc
4、ularendothelialgrowthfactorreceptor,VEGFR)作為靶分子的抗腫瘤新藥研發(fā)取得了很大的進(jìn)展，已經(jīng)有數(shù)個藥物經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)上市。重組人源化的鼠單克隆抗體(mAb)Avastin[2],可有效地抑制多種人類腫瘤細(xì)胞移植瘤的生長，高親合力地結(jié)合VEGF,可直接阻斷VEGF通過VEGFR的信號表達(dá)。本研究屮，我們構(gòu)建了谷光甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)與雞源VEGF(cVEGF)融合基因的原核表達(dá)重組質(zhì)粒，在大腸桿菌屮進(jìn)行蛋口質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)，并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化及復(fù)性，再進(jìn)一?步研究該融合蛋白疫苗對小鼠
5、Lewis肺癌腫瘤模型的抗血管生成主動免疫治療效果。1材料和方法1」材料質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、各種限制性核酸內(nèi)切酶、ExTaq酶、T4DNA連接酶均購自TaKaRa公司；弗氏完全佐劑，不完全佐劑購自Sigma公司；重組人VEGF165抗原購自美國PeproTechEC公司；山羊抗小鼠IgG-HRP購口SantaCruz公司；96孔酶標(biāo)板NUNC公司產(chǎn)品；次氮基三乙酸銀瓊脂糖(Ni?NTA)和蛋白質(zhì)分離純化柱購Qiagen公司；小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存;4周齡C57BL/6J小鼠(?)購自中國科學(xué)院上海生
6、化細(xì)胞研究所。1.2方法1.2.1VEGF基因克隆及原核表達(dá)載體的構(gòu)建為了利于表位Z間以及表位與蛋白之間的融合，在GST的基因序列與cVEGF基因序列之間引入6個Gly的柔性接頭序列，并在下游引入HIS?Tag基因序列以便于對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，設(shè)計帶EcoRI-XhoI酶切位點(diǎn)的引物PrimerI(由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成)：丄游：5r-GCGAATTCCGGGCGGTGGCGGTGGCGGTAACTTTCTGCTCACTTGGATC-3，o下游：5LGGCTCGAGCTCAGTGATGGTGATGGTGATGC
7、CGTCTCGGTTTTTCACA?3'。以pMD18-T-cVEGF質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室保存)為模板,PCR擴(kuò)增，條件為：94°C變性4min;94°C30s,58°C30s,72°C1min,共30個循環(huán);最后72°C延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切回收連接至pGEX-4T-2原核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株。PCR和雙酶切鑒定，并進(jìn)行測序鑒定(捷瑞生物工程(上海)有限公司測部)。1.2.2融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化挑取陽性菌株，在終濃度為0.8mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。分別收取誘導(dǎo)前后標(biāo)本，超聲破菌
8、，作聚內(nèi)烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。大規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng)菌體，將所得包涵體經(jīng)洗滌液(含5g/LTritonX-100,10mmol/LEDTA,pH&O)反復(fù)洗滌3次，再分別用2mol/L,4mol/L尿素洗滌3次，變性溶解在含10mmol/L基乙醇的8mol/L尿素屮，按Qiage
