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1、南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)JournalofSouthernAgriculture2014，45(10)：1861—1865ISSN2095—1191；CODENNNXAABhttp：／／www．nfnyxb．cnDOI：10．3969／j：issn．2095—1191．2014．10．1861大鼠胰島素Ⅱ基因啟動(dòng)子克隆與功能驗(yàn)證韋玲靜，黃碉萌，嚴(yán)雪瑜，蔣欽楊+，蘭干球，郭亞芬(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧530005)摘要：【目的】克隆大鼠胰島素II基因啟動(dòng)子(PdP2)序列并對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證，為培育胰島特異性表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā扛鶕?jù)Ge
2、nBank中已發(fā)表的R／P2序列(J00748．1)設(shè)計(jì)引物，以大鼠基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增R／P2序列，連接pMDl8．T載體后用H／ridIII和BamI-II進(jìn)行雙酶切，回收R／P2片段并連接至不含啟動(dòng)子的pEGFP．1載體上構(gòu)建真核表達(dá)載倒kpEGFP．1．R／P2。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PKl5細(xì)胞，24hA觀察細(xì)胞熒光蛋白表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】克隆獲得的R／P2序列與參考序列(J00748．1)的同源性為99．9％，存在3處堿基差異，即從起始密碼子ATG(+I)上游．57處有一個(gè)G堿基缺失，．387處c突變?yōu)锳，．707處插入一個(gè)G堿基。mP2序
3、列存在一個(gè)TATA．box(．206---201位點(diǎn))和一個(gè)CAAT．box(．343~一339位點(diǎn))。以重組質(zhì)粒pEGFP．1．剮P2轉(zhuǎn)染PKl5細(xì)胞，24hA能觀察到綠色熒光?！窘Y(jié)論】克隆獲得的大鼠R／P2序歹IJ具有啟動(dòng)子功能，但活性較CMV啟動(dòng)子弱。關(guān)鍵詞：大鼠；胰島素Ⅱ基因啟動(dòng)子；克隆；功能驗(yàn)證；真核表達(dá)載體中圖分類(lèi)號(hào)：Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095一1191(2014)10—1861—05Cloningandfunctionalverificationofrat-?·insulin2genepromoterWEILing-jin
4、g，HUANGYue-meng，LANGan-qiu．YANXue—yu，JIANGQin-yang+，GUOYa—fen(CollegeofAnimalAcienceandTechnology，GuangxiUniversity，Nanning530005，China)Abstract：【Objective】CloningandfunctionalverificationofRatinsulin2promoter(R艘)wereconductedtolaythefoundationforbreedingtransgenicanimalsofspec
5、ificexpressiontargetgenesofinsulin．【Method】AccordingtotheR胞sequence(No．J00748．1)waspublishedinGenBank，apairofprimerwasdesignedtoamplifytheRIP2sequencebyPCRmethod．TheRjP2sequencewasconnectedtothepMDl8一Tvector．therestructuringvectorwasdoublydigestedby／-／／ndIIIandBamHI，andthenther
6、ecyclingRIP2sequencewasconnectedtopEGFP—lvectortoconstructthepEGFP—l—RIP2expressionvector．TheconstructingvectorwastransfectedintoPKl5cells．a(chǎn)ndfluorescentproteinexpressionincellswasobservedafter24houm．【Result】TheclonedRJP2sequencewas703bp(一87l一一169sites)inlengthandhad99．9％ofhomo
7、logyt}lereferencesequence(No．J00748．1)．r11lereexisted3basemutations，frominitiationcodonATGupstream(+1)．Gbasedeletionwasat一57site，C／Amutationat一387site，Gbaseinsertionat一707site．TheRJP2sequencecontained2promoterelements：TATA—box(一206一一201sites)andCAAT—box(一343N--339sites)．Greenfl
8、uorescenceWasobservedfromthePKl5cellstransfectedpEGFP—
