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1、中國動物傳染病學(xué)報2009，17(4)：36—42ChineseJournalofAnimalInfectiousDiseases·研究論文·抗豬胸膜肺炎放線桿菌ApxlV毒素單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用張志妮，張偉娟，林燕清，顧萬軍，黃良宗，朱軍，姚豐華，朱國強(qiáng)(1．揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州225009；2．佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，佛山528231)摘要：據(jù)豬胸膜肺炎放線桿茵(Actinobacilluspleuropneumoniae，App)apxⅣ毒素基因5端的保守區(qū)域設(shè)計一對特異性引物，應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增出致病性App1～12血清型菌株的保守5端
2、序列片段，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pETapxIVN經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出分子量大小為35．3kDa的可溶性重組蛋白。以親和層析試劑盒純化的重組蛋白免疫BAIB／c小鼠制備抗ApxIV毒素單克隆抗體(McAb)。以間接ELISA法篩選到兩株分泌穩(wěn)定、抗體亞類均為IgG1的雜交瘤細(xì)胞5H7和5C11，其培養(yǎng)上清和小鼠腹水抗體效價分別為1：64、1：128和1：64000、1：128000．兩株單抗與臨床豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒、豬呼吸道繁殖障礙綜合征病毒、豬黃、白痢產(chǎn)腸毒素大腸桿菌和豬肺疫多殺性巴氏桿菌感染陽性血清均不發(fā)生交叉反應(yīng)，顯示出良好的特異性．競爭性結(jié)合試驗表明兩株單
3、抗識別不同的抗原結(jié)合表位．以(NH)2S()4鹽析法純化的5C11小鼠腹水單抗包被酶標(biāo)板，生物素標(biāo)記純化的5B7單抗建立了檢測Apxl~[毒素的雙抗體夾心E1ISA法，其包被單抗最佳工作濃度為4／lg／ml，生物素標(biāo)記單抗最佳_7-作濃度為0．8／lg／mI，對重組表達(dá)ApxIV毒素(rApxlV)的最低檢出量為60pg／mL。從1O份臨床病豬血清樣本中檢出6份ApxlV毒素陽性，與細(xì)菌分離鑒定和PCR結(jié)果相符合，結(jié)果表明此法可用于App感染的臨床診斷。關(guān)鍵詞：豬胸膜肺炎放線桿菌；ApxⅣ毒素；表達(dá)；單克隆抗體中圖分類號：S858．282．619：Q785文
4、獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1674—6422(2009)04—0036—07DEVELoPMENTANDPRIMARYAPPLICATIoNoFMoNoCLoNALANTIBoDIESAGAINSTAPXⅣoFACTINoBACILLUSPLEURoPNEUMoNlAEZHANGZhi～ni，ZHANGWei-juan，LINYan—qing，GUWan_u，HUANGLiang—zongz，ZHUJun，YAOFeng—hua，ZHUGuo—qiang(J．CollegeofVeterinaryMedicine，YangzhouUniversity，Yangz
5、hou225009，China；2．Schoolo／’LfeScience，F(xiàn)oshanUniversity，F(xiàn)oshan528231，China))Abstract：TheN—terminalconservedsequencesofapxIVgenefromActinobacilluspleuropneumoniae(App)serotypes1～12wereamplifiedbyPCRandclonedintotheprokaryoticplasmidpET-22b(+)toconstruCtrecombinantplasmidpETapxIVN．A35
6、．3kDasolublerecombinantprotein(rApxIVN)wereexpressedandpurifiedbyNi—TED(tris—carboxymethylethylenediamine)immobilizedmetalionaffinitychromatography(IMAC)．BALB／cmicewereimmunizedwithpurifiedrApxIVNandtwohybridomacelllinessecretingmonoclonalantibodies(MAbs)of5B7and5Cllwereidentified．
7、TheELISAtitersof5B7收稿Et期：2009—10—10基金項目：國家十一五科技支撐項目(2006BAD06A12)作者簡介：張志妮，女，碩士研究生，主要從事病原微生物學(xué)研究通訊作者：朱圍強(qiáng)，E-mail：yzgqzhu@hotmail．com第17卷第4期張志妮：抗豬胸膜肺炎放線桿菌ApxlV毒素單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用一37and5Cllwere1：64and1：128inculturesupernatants，and1：64000and1：128000inascites．BothMAbsshowednocross—reactionswi
8、thporcineseraofclassicalsw
