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1、◆試驗(yàn)研究◆2010年第1期辣椒雜志(季刊)利用SSR分子標(biāo)記建立辣椒純度鑒定體系白占兵，李雪峰，戴雄澤，(1湖南省蔬菜研究所湖南長(zhǎng)沙4101252湖南省蔬菜工程技術(shù)研究中心湖南長(zhǎng)沙410125)摘要從150對(duì)辣椒SSR引物中篩選出116對(duì)多態(tài)性較好的引物，對(duì)興蔬種業(yè)的12個(gè)推廣辣椒品種的父本、母本及其F代共36份材料進(jìn)行PCR差異性篩選，其中6對(duì)引物能夠區(qū)分每個(gè)品種的父本、母本及其F代；同時(shí)對(duì)辣椒大群體DNA的快速提取、PCR擴(kuò)增以及制膠電泳等進(jìn)行了優(yōu)化，初步建立了基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)的辣椒種子純度鑒定體系。為辣椒種子純
2、度鑒定工作者提供了參考，也為辣椒種子指紋圖譜的建立奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞辣椒；SSR；純度辣椒(CapsicumaHnuumL．)是我國(guó)重要的蔬菜，水稻雜交種的純度體系，并注冊(cè)國(guó)家專利，產(chǎn)生也是重要的調(diào)味品，目前我國(guó)辣椒年種植面積了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。130160萬(wàn)hm，總產(chǎn)值270300億元，需要雜交我國(guó)辣椒每年采用傳統(tǒng)種子純度鑒定方法需要種9751200t。隨著育種進(jìn)程的加快，辣椒品種急土地554．8～655．2hm2，費(fèi)用2500～2900萬(wàn)元，如果劇增多，優(yōu)質(zhì)雜交種的種類和需求量的日益增加，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)只需2226
3、萬(wàn)元即可完成使辣椒雜交種質(zhì)量鑒定研究工作顯得極其重要。傳純度鑒定。因此，辣椒種子純度鑒定SSR技術(shù)體系統(tǒng)鑒定一般采用田間鑒定法，其依賴于品種表型差的建立不但為種子企業(yè)節(jié)約了種子純度鑒定成本、異，而大多數(shù)形態(tài)性狀易受環(huán)境影響，地點(diǎn)、年度間為市場(chǎng)提供了優(yōu)質(zhì)的種子，還緩減我國(guó)人多地少的也會(huì)表現(xiàn)出一定程度的差異，嚴(yán)重的影響了品種純矛盾，對(duì)我國(guó)辣椒雜交種種業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展具有度鑒定的準(zhǔn)確性，真實(shí)性。重要意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，分子標(biāo)記技本研究旨在利用SSR在辣椒基因組中分布比術(shù)已成為作物品種真實(shí)性和純度鑒定的發(fā)展方向。較均
4、一，提供的遺傳信息多，且具有重復(fù)性好，穩(wěn)定目前，SSR分子標(biāo)記技術(shù)在鑒定種子純度方面已得性高，成本較低廉和易于操作等優(yōu)點(diǎn)，建立辣椒雜交到廣泛應(yīng)用。其技術(shù)原理是從農(nóng)作物中分離出位點(diǎn)種純度快速鑒定SSR分子標(biāo)記技術(shù)體系，為辣椒種特異微衛(wèi)星SSR，然后利用兩端的獨(dú)特序列設(shè)計(jì)一子純度鑒定工作者提供參考，同時(shí)為辣椒種子指對(duì)引物，利用PCR擴(kuò)增微衛(wèi)星的長(zhǎng)度多態(tài)性片段，紋圖譜的建立奠定基礎(chǔ)。以達(dá)到種子純度鑒定的目的。石海波等『11報(bào)道用SSR標(biāo)記可以鑒別小麥種子的純度。姚鳳霞等嘲報(bào)道用1材料與方法SSR分子標(biāo)記可以鑒定掖單l3號(hào)種子純度。
5、利用分1．1材料子標(biāo)記鑒定水稻雜交種的純度在日本已推廣；目材料全部來(lái)自于湖南興蔬種業(yè)有限公司，分別前，湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)院已經(jīng)完善建立了SSR分子鑒定為：博辣嬌紅、博辣紅玉、博辣紅牛、博辣紅秀、興蔬收稿日期：2010—02—08基金項(xiàng)目：湖南省科技公共平臺(tái)建設(shè)專項(xiàng)“春夏蔬菜產(chǎn)業(yè)提升關(guān)鍵技術(shù)研究”(項(xiàng)目編號(hào)K0802172—61)作者簡(jiǎn)介：白占兵(1977一)，男，主要從事分子標(biāo)記輔助育種32辣椒雜志(季刊)2010年第1期◆試驗(yàn)研究◆201、興蔬301、興蔬201、興蔬綠燕、福湘秀麗、福湘1．2．4PCR產(chǎn)物的檢測(cè)擴(kuò)增完成后在8％
6、聚丙烯碧秀、福湘佳玉、福湘探春及其它們的父母本，酰胺凝膠上電泳(160V，140min)，電泳完成后觀察共計(jì)36份。記錄并照相。1．2方法1．2．1辣椒總DNA的提取純度鑒定由于樣本較2結(jié)果與分析大，如何快速低成本提取大批量的DNA成為本實(shí)2．1引物篩選與鑒定驗(yàn)的重點(diǎn)和難點(diǎn)，本文采用簡(jiǎn)化CTAB法提取辣椒從150對(duì)辣椒SSR引物中初步篩選出116對(duì)的總DNA，且只需倒換試管一次，便可以獲得高純多態(tài)性較好的引物，對(duì)36份樣進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果度、高產(chǎn)量的DNA。表明，除個(gè)別引物對(duì)個(gè)別材料沒(méi)有擴(kuò)增出條帶，大1．2．2PCR反應(yīng)體
7、系10×Buffer(含Mg2+)1．5l，多數(shù)能擴(kuò)增出清晰的譜帶，且重復(fù)性較好。為了使10mmol／LdNTP0．1875~1，10I,zmol／L引物0．6l，每個(gè)品種至少有一對(duì)引物能鑒定出其個(gè)體遺傳多模板DNA10ng，TaqDNApolymerase0．6U，其余用態(tài)性，通過(guò)PCR反復(fù)篩選，共獲得6對(duì)能夠鑒定出ddH2O補(bǔ)充至l5l。每個(gè)辣椒品種父本、母本及F。的多態(tài)性引物(F，譜1．2．3PCR擴(kuò)增條件94~(2預(yù)變性3min，94％變性帶是其父母本譜帶的互補(bǔ)帶)(圖1)，第4號(hào)引物鑒30S，55oC退火30S，7
8、2~C延伸60s，35個(gè)循環(huán)，72~C定福湘2號(hào)的結(jié)果見(jiàn)圖2。延伸10min。2．2分析福湘探春博辣紅秀福湘秀麗福湘佳玉博辣紅玉興蔬綠燕早6F早6F。早6F早6F16F16F37號(hào)引物116號(hào)引物33號(hào)引物圖1不同引物鑒定不辣椒品種結(jié)果圖24號(hào)引物對(duì)福湘2號(hào)鑒定結(jié)果從圖1和圖2可以清楚地看
