玉米種子純度SSR分子標(biāo)記鑒定方法

《玉米種子純度SSR分子標(biāo)記鑒定方法》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。

1、辣椒種子純度SSR分子標(biāo)記鑒定技術(shù)規(guī)程編制說(shuō)明沈陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院2017年5月《辣椒種子純度SSR分子標(biāo)記鑒定技術(shù)規(guī)程》標(biāo)準(zhǔn)編制說(shuō)明一、工作簡(jiǎn)況，包括任務(wù)來(lái)源、協(xié)作單位、主要工作過(guò)程、主要起草人及其所做的工作；2016年5月沈陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院通過(guò)遼寧省農(nóng)村經(jīng)濟(jì)委員會(huì)和沈陽(yáng)市質(zhì)量監(jiān)督局向遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局提交《項(xiàng)目建議書(shū)》，建議編制《辣椒種子純度SSR分子標(biāo)記鑒定技術(shù)規(guī)程》標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)審查及公示，項(xiàng)目被列入遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂2017年度計(jì)劃，立項(xiàng)編號(hào)為2016073，沈陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院為項(xiàng)目承擔(dān)單位。項(xiàng)目立項(xiàng)后，項(xiàng)目承擔(dān)單位成立了標(biāo)準(zhǔn)起草小組，落實(shí)了標(biāo)準(zhǔn)起草經(jīng)

2、費(fèi)，提供了必要的工作條件。標(biāo)準(zhǔn)起草小組的成員有：楊雙、張曼麗、劉延斌、李金鳳、馬東梅、潘菊、胡穎、孫嘉興、李雪、宋偉。楊雙為技術(shù)總負(fù)責(zé)；李金鳳、馬東梅負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)樣品收集；潘菊、胡穎負(fù)責(zé)技術(shù)資料檢索；劉延斌、孫嘉興、李雪負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)參數(shù)確定。標(biāo)準(zhǔn)起草小組在批準(zhǔn)立項(xiàng)的一個(gè)月內(nèi)制定了具體的標(biāo)準(zhǔn)起草計(jì)劃。按照計(jì)劃，2016年12月前完成資料收集、相關(guān)調(diào)研及試驗(yàn)驗(yàn)證；2017年4月聘請(qǐng)省內(nèi)農(nóng)業(yè)專(zhuān)家對(duì)征求意見(jiàn)稿進(jìn)行修改；5月完成意見(jiàn)整理、分析和處理，填寫(xiě)地方標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)匯總表；5月申請(qǐng)專(zhuān)家審查。二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定地方標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容（如技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)、公式、性能要求

3、、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則）的依據(jù)。地方標(biāo)準(zhǔn)修訂項(xiàng)目，還應(yīng)列出和原標(biāo)準(zhǔn)主要差異情況；辣椒(CapsicumannuumL.)是遼寧省八大蔬菜作物之一，省內(nèi)廣泛種植，隨著辣椒雜交種的種植面積不斷擴(kuò)大，種子純度問(wèn)題顯得尤其重要。在辣椒制種過(guò)程中，無(wú)論使用兩系雜交或者三系雜交，雜交一代種子中易于混入母本種子。由于親本的生產(chǎn)力弱，產(chǎn)量低，純度不夠的種子對(duì)辣椒生產(chǎn)造成影響。在辣椒生產(chǎn)過(guò)程中，常常出現(xiàn)因種子純度不高造成產(chǎn)量降低、品質(zhì)變劣，商品性不好，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益。因此，大力開(kāi)展辣椒種子純度檢測(cè)工作顯得尤其重要。目前鑒定辣椒種子純度一般采用田間種植或室內(nèi)酯酶同工酶電泳

4、等方法，這些方法雖簡(jiǎn)便易行，但田間種植僅靠形態(tài)觀(guān)察較難做到準(zhǔn)確判斷，且耗時(shí)長(zhǎng)，同工酶檢測(cè)也會(huì)因環(huán)境和發(fā)育時(shí)期而發(fā)生變化，導(dǎo)致電泳結(jié)果不易判讀。建議制定基于DNA多態(tài)性，依托SSR分子標(biāo)記技術(shù)，具有快速、準(zhǔn)確、易操作等特點(diǎn)的鑒定辣椒種子純度技術(shù)規(guī)程，適用于省內(nèi)主栽的辣椒品種的純度鑒定，提高商品種子質(zhì)量，為質(zhì)量監(jiān)督管理部門(mén)提供參考，同時(shí)也為辣椒品種指紋圖譜的建立和品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)打下基礎(chǔ)。SSR（SimpleSequenceRepeat）是一類(lèi)由幾個(gè)（多為1-6個(gè)）堿基組成的基本單元串聯(lián)重復(fù)形成，廣泛存在于真核生物的基因組中。由于個(gè)體基因組中每個(gè)SSR位

5、點(diǎn)的重復(fù)單元在數(shù)量上存在多態(tài)性，可用于鑒別不同個(gè)體?；蚪M中這些SSR位點(diǎn)的側(cè)翼DNA片段通常都是保守性較強(qiáng)的單一序列，可以根據(jù)側(cè)翼的DNA片段的堿基序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將單個(gè)SSR位點(diǎn)擴(kuò)增出來(lái)。不同個(gè)體的擴(kuò)增產(chǎn)物在長(zhǎng)度上的變化就產(chǎn)生多態(tài)性，可用來(lái)鑒別不同個(gè)體。辣椒屬于被子植物。根據(jù)被子植物發(fā)育原理，種皮是由珠被發(fā)育來(lái)的，其細(xì)胞內(nèi)的2N條染色體全部來(lái)自母本；胚是由受精卵發(fā)育來(lái)的，其細(xì)胞內(nèi)的2N條染色體一半來(lái)自卵細(xì)胞（母方），一半來(lái)自精子（父方）；胚乳是由受精的極核發(fā)育來(lái)的，其細(xì)胞內(nèi)的3N條染色體有2N條來(lái)自極核（母方），N條來(lái)自精子（父方）。

6、這樣1粒雜交一代的種子的種皮為母本基因型，胚為雜交種基因型，在實(shí)際應(yīng)用中，不需要提供親本也可以通過(guò)雜交種獲得親本基因型數(shù)據(jù)。三、主要試驗(yàn)（或驗(yàn)證）的分析報(bào)告、相關(guān)技術(shù)和經(jīng)濟(jì)影響論證、預(yù)期的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益；1.DNA制備方法植物體任何部分都可以用來(lái)提取DNA，但是幼葉相對(duì)容易，種子和種皮相對(duì)較難，因?yàn)榉N皮中含有大量纖維素，細(xì)胞壁厚，裂解難。解決種子和種皮的DNA提取是本研究的難點(diǎn)。采用天根公司的植物基因組DNA提取試劑盒，種子和種皮提取時(shí)，通過(guò)延長(zhǎng)裂解時(shí)間，取消漂洗步驟，無(wú)菌水反復(fù)沖洗等步驟，以期減少DNA損失，提高DNA提取量。提取幼葉時(shí)正常按照說(shuō)明書(shū)提

7、取。用純水浸泡辣椒種子過(guò)夜，剝?nèi)±苯贩N皮及種子20mg左右（約5粒左右）至2.0ml離心管中，將液氮加入其中并迅速研碎，加入裂解液LP1，原裂解時(shí)間為10min，改為20min，取消漂洗過(guò)程，其余操作步驟同試劑盒說(shuō)明。幼葉取100mg左右，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量，結(jié)果如圖1所示。圖1DNA電泳結(jié)果注：1，2，3—種皮；4，5，6—種子；7，8，9—幼葉結(jié)果顯示，以植株幼葉為材料獲得的DNA質(zhì)量最好，但是從種子催芽到萌發(fā)需要2周左右時(shí)間，耗時(shí)長(zhǎng)。以種子、種皮為材料獲得的DNA相對(duì)幼葉較少，但也可見(jiàn)清晰條帶

8、。2．純度鑒定技術(shù)參考管俊嬌等（2014）、劉子記等（2014）及李晶晶（2009）的相關(guān)研究