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《納豆激酶基因的克隆和高效表達(dá)-論文.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，39(4)：556．559JournalofAnhuiAgriculturalUniversity網(wǎng)絡(luò)出版時間：2012．7．417：47：40[URL]http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1162．S．20120704．1747．019．html納豆激酶基因的克隆和高效表達(dá)王偉，甘露，甘旭華，陳曉琳，倪敬田，唐欣昀(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥230036)摘要：為了克隆納豆激酶(Na~okinase，NK)基因，實現(xiàn)納豆激酶在大腸桿菌中的表達(dá)，并對其表達(dá)條件進(jìn)行研究，首先以從枯草芽孢桿菌中提取
2、的基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增包括信號肽、前導(dǎo)肽、成熟肽序列的前納豆激酶原基因，將其克隆到載體pET28a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-NK，成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)；然后優(yōu)化影響該基因表達(dá)的溫度、時間和IPTG添加量等因素。結(jié)果表明，重組菌株BL21(DE3)．NK在20℃下培養(yǎng)、IPTG添加量為0．4mmol·L。。、培養(yǎng)20h時表達(dá)產(chǎn)物的纖溶活性最大，可達(dá)到81．73U·mL～，SDS—PAGE檢測觀察到1條38kDa的蛋白條帶，與預(yù)期相符。關(guān)鍵詞：納豆激酶；枯草芽孢桿菌；基因克??；表達(dá)中圖分類號：Q785文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1672
3、—352X(2012)04—0556—04Cloningandhigh-efficiencyexpressionofnattokinasegeneWANGWei，GANLu，GANXu-hua，CHENXiao—lin，NIJing—tian，TANGXin—yun(SchoolofLifeScience，AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei230036)Abstract：Inthisstudy,thenattokinasegenewithsignalpeptide，propeptideandmaturepeptidewasclo
4、nedandexpressedinEscherichiacoli．a(chǎn)ndtheinductionandexpressionparameterswereoptimized．ThegenewasamplifiedwithgenomicDNAextractedfromBacillussubtillisastemplatebyI1-PCR，digestedandligatedwithexpressionvectOr_DET28atoconstructrecombinantplasmidpET28a．NKwhichwastransformedintoEcolistrai
5、nBL21(DE3)．Inductionconditionssuchastime，temperatureandIPTGconcentrationwerestudied．a(chǎn)ndthehigh．estfibfinolyticactivitywasobtainedanditcouldreach81．73U·mL。。whenrecombinantstrainBL21rDE3)一NKwascultivatedat20℃for20hwithIPTGat0．4mmol·L一．Anexpectedproteinbandabout38kDawasobservedbySDS—PA
6、GE．Keywords：nattokinase；BacillussubtillPs；geneclone；expression納豆(natto)是具有一定生理功能的保健食化納豆激酶的純化方法等【6{]手段；Nakamura等人品?。1987年Sumi[21首次從納豆中分離出一種具有于1992年公布了納豆激酶基因序ydt，使得利用基溶栓功能的納豆激酶(Nattokinase，NK)，該酶是由因工程方法生產(chǎn)納豆激酶成為可能。目前大多數(shù)學(xué)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtile)的一個亞種一納豆者選擇克隆含有前導(dǎo)肽和成熟肽[10-12域者只含有成芽孢桿菌(Baci
7、llusnatto)發(fā)酵產(chǎn)生的一種具有強(qiáng)烈熟肽[13-14]的納豆激酶基因片段，但都存在表達(dá)出的溶栓功效的堿性絲氨酸蛋白酶【3】，當(dāng)納豆激酶被口酶活性不高甚至沒有活性的問題。本試驗利用PCR服時，纖溶活性會提高，并且在血漿中能夠持續(xù)很方法獲得含有信號肽、前導(dǎo)肽、成熟肽的前納豆激長時間【4]。鑒于納豆激酶的食物背景、強(qiáng)烈的纖溶酶原基因，成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-NK，使活性以及在腸胃中的穩(wěn)定性，使得它比市場上的其重組質(zhì)粒在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具它商用藥物都具有優(yōu)勢L5J。為了獲得大量的納豆激有較高纖溶活性，為納豆激酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供試酶，國內(nèi)
8、主要采用改善納豆桿菌液體發(fā)酵條件、優(yōu)驗
