納豆激酶論文：納豆激酶優(yōu)化、提取分離純化及基因克隆

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1、納豆激酶論文：納豆激酶的優(yōu)化、提取分離純化及基因克隆【中文摘要】心腦血管性疾病,具有“發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高、并發(fā)癥多”納豆激酶論文：納豆激酶的優(yōu)化、提取分離純化及基因克隆【中文摘要】心腦血管性疾病,具有“發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高、并發(fā)癥多”等特性。2005年,世界衛(wèi)生組織(WHO)調(diào)查表明,全世界每年約有1700萬人死于心腦血管疾病。并且隨著人類生活水平的提高以及生活壓力的增加,而呈現(xiàn)年輕化的趨勢,而血栓又是心腦血管疾病中致死率最高的疾病。所以,血栓的防治已是當務之急。雖然傳統(tǒng)藥物在心腦血管及血栓栓塞性疾病防治上療效顯著,但毒副作用嚴重;而傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品不僅效果顯著且安全無毒,可

2、作為一種具有開發(fā)和利用價值的功能性預防保健食品。據(jù)文獻記載,納豆源于中國的豆豉,通過佛教由中國傳入日本,日本人均壽命長的原因除了與較為優(yōu)良的自然環(huán)境有關(guān)外,更重要的是其膳食結(jié)構(gòu)中,發(fā)酵食品特別是消費量最大的納豆,是日本人長壽的秘方,視為國寶級食品。寺院喜食大豆是因為其蛋白質(zhì)含量高達35.3%,而由納豆菌產(chǎn)出的酶,能使50%的蛋白質(zhì)變?yōu)樗苄?消化率可達80%。還含氨基酸、維生素、植物性脂肪等。據(jù)科學研究表明,納豆食品不僅調(diào)整胃腸功能明顯,還具有治療感冒、痢疾、脹氣、胃腸炎、消化不良、殘便、便秘等功效,還有防治糖尿病,抑制血栓的生成和溶解血栓的作用,是一種延年益壽、健康的美容食品?？梢哉f納豆是一

3、種自然食品,是人類生活智慧的產(chǎn)物。1987年日本的Sumi博士首次從日本傳統(tǒng)食品納豆中分離出一種具有強烈纖溶作用的堿性蛋白酶并命名納豆激酶(nattokinase,NK)。它不但能直接作用交聯(lián)纖維蛋白,而且還可激活體內(nèi)的纖溶酶原,從而表現(xiàn)出很強的溶血栓作用。據(jù)報道其制品具有水解淀粉樣蛋白,降低血漿纖維蛋白原的第七因子和第八因子,降低血液粘度、降血脂、降膽固醇,降血壓,改善血液循環(huán)狀態(tài),維持血細胞的正常形態(tài)和功能,有利于神經(jīng)損傷的再生,抑制骨質(zhì)疏松癥、抑制動脈粥樣硬化等多種功能。由于NK具有安全性好、成本低、經(jīng)口服后可迅速入血,作用時間長,胃腸道穩(wěn)定性好,可由細菌發(fā)酵生產(chǎn)、也可由基因工程菌生產(chǎn)等

4、優(yōu)點,有望被開發(fā)為新一代的口服抗血栓藥物用于血栓性疾病的預防和治療。但是直到現(xiàn)在,納豆激酶的來源主要是發(fā)酵的日本納豆,因其獨特的風味很多人不能接受。雖然含有納豆激酶作為主要成分的膠囊制劑已在日本,韓國,朝鮮生產(chǎn),但由于只能短期供應和高昂的代價,其應用很有限。為了使其既方便又廣泛使用,人們從分子生物學角度尋找更好的表達載體和宿主菌,優(yōu)化表達條件等方面做了進一步的研究,應用基因工程制品純化出更為優(yōu)質(zhì)的溶栓藥物,將具有更為廣泛的應用前景,給臨床帶來新的曙光。本研究通過發(fā)酵液優(yōu)化、鹽析、層析、蛋白含量、纖溶活力測定、SDS-PAGE等技術(shù)和手段,通過傳統(tǒng)方法提取分離純化納豆激酶,檢測其活性。還通過分子

5、生物學技術(shù),提取納豆枯草芽孢桿菌基因組DNA,設計引物,PCR克隆納豆激酶及納豆激酶原。選擇合適的表達表達載體和宿主菌,以期應用基因工程制品純化出更為安全優(yōu)質(zhì)溶栓藥物,為臨床應用提供理論依據(jù)。方法1.本實驗通過比濁法連續(xù)測定OD600值,繪制菌種生長曲線,確定納豆菌培養(yǎng)條件,以便更好地應用于實際生產(chǎn)中。為了進一步提高酶的產(chǎn)量,降低發(fā)酵成本,我們采用單因素和正交實驗法對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。2.將粗酶液經(jīng)離心,40~45%鹽析,CM-Cellulose離子交換層析和SephadexG-100凝膠柱可以提取出單一酶,并用SDS-PAGE測定分子量,比較粗酶液與提取出的單一酶液的酶活力。3.納豆枯草芽孢

6、桿菌基因組DNA提取后,經(jīng)PCR擴增納豆激酶及納豆激酶原序列,并經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。為進一步構(gòu)建重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌做鋪墊,后續(xù)工作有待進一步研究。結(jié)果1.培養(yǎng)基成分的最優(yōu)組合為MgSO40.02%、K2HPO40.02%、KH2PO40.01%、CaCl20.05%、麥芽糖3%、大豆蛋白胨3%、最適培養(yǎng)溫度37℃、最適pH為8.0、最佳接種量為每5g黃豆接種500μL。優(yōu)化發(fā)酵條件后生產(chǎn)的納豆激酶,酶活由優(yōu)化前的31.25IU/mL發(fā)酵液提高到158.74IU/mL發(fā)酵液,單位產(chǎn)量提高了約5.08倍。2.經(jīng)CM-Cellulose離子交換層析分離納豆激酶酶,得到0.10mol/LN

7、aCl洗脫峰中含有活性組份,Folin-酚法測酶活為168.56IU/m。將0.10mol/LNaCl洗脫峰中的納豆激酶酶用SephadexG-100凝膠過濾層析進行分離,Folin-酚法測酶活為137.16IU/mL,并用SDS-PAGE測定它們的分子質(zhì)量為28000Da。3.納豆枯草芽孢桿菌基因組DNA提取后,經(jīng)PCR擴增納豆激酶(275個氨基酸,堿基825bp)及納豆激酶原序列(381個氨基