630490 酵母雙雜交文庫(kù)構(gòu)建實(shí)驗(yàn)流程(clontech)

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1、酵母雙雜交文庫(kù)構(gòu)建基本實(shí)驗(yàn)流程第一鏈cDNA合成1.準(zhǔn)備:高質(zhì)量的PolyA或總RNA2.在微量離心管中混勻以下試劑：+1–2μlRNA樣本(0.025–1.0μgpolyA或0.10–2.0μg總RNA)1.0μlCDSIII或CDSIII/6引物1–2μl去離子水(補(bǔ)齊體系到4.0μl)4.0μl總體積注意:對(duì)照實(shí)驗(yàn)時(shí)，請(qǐng)使用1μl*1μg+的對(duì)照RNA。CDSIII=Oligo-dT；引物CDSIII/6=隨機(jī)引物3.72°C，孵育2min。4.冰上冷卻2min，然后14000rpm，10sec，瞬時(shí)離心。

2、5.混合以下試劑，將混合液加入Step4中的經(jīng)過(guò)變性且結(jié)合有引物的RNA樣本中，輕拍混勻。2.0μl5XFirst-Strand緩沖液1.0μlDTT(100mM)1.0μldNTP混合物(10mM)1.0μlSMARTMMLV反轉(zhuǎn)錄酶9.0μl總體積6.只有使用隨機(jī)引物(CDSIII/6)實(shí)驗(yàn)才進(jìn)行此步驟[如果采用Oligo-dT(CDSIII)請(qǐng)忽略此步驟，直接進(jìn)行Step7]，25°C，室溫孵育10min。7.42°，孵育10min。注意:孵育在熱蓋的PCR儀中進(jìn)行。若用非熱蓋的PCR儀或水浴，請(qǐng)?jiān)诜磻?yīng)管中

3、加入一滴礦物油來(lái)避免水分蒸發(fā)。8.加入1μlSMARTIII-modifiedoligo，混勻，42°C，孵育1hr。9.75°C，10min終止第一鏈合成反應(yīng)。10.室溫冷卻，加入1μlRNA酶H(2U)。11.37°，孵育20min。12.繼續(xù)進(jìn)行LD-PCR擴(kuò)增(SectionVII.B)。注意:–20°C下可保存3個(gè)月。第一鏈反應(yīng)最終體積為15μl?10μlSMARTIIIOligo(10μM;5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’)?10μlCDSII

4、I引物(10μM;5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN-3’)*23個(gè)堿基?10μlCDSIII/6引物(10μM;5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-NNNNNN-3’)注意:N=A,G,C,orT;V=A,G,orC?50μl5’PCR引物(10μM;5’-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3’)25個(gè)堿基?50μl3’PCR引物(10μM;5’-GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGC

5、GGCCGACA-3’)1/4酵母雙雜交文庫(kù)構(gòu)建基本實(shí)驗(yàn)流程第二鏈cDNA合成（LD-PCR）盡量使用最小的循環(huán)數(shù)來(lái)得到3-6ug的dscDNA。TableIII中最優(yōu)的循環(huán)數(shù)取決于對(duì)照小鼠肝臟RNA的起始量。最優(yōu)循環(huán)數(shù)隨著模板量、物種的不同而變化。這個(gè)程序是經(jīng)過(guò)優(yōu)化適用于Advantage2聚合酶混合物(Cat.No.639201)。使用其他的酶時(shí)需要摸索最優(yōu)循環(huán)數(shù)。TableIII:RNA起始量與PCR循環(huán)數(shù)的關(guān)系總RNA(μg)PolyA+RNA(μg)循環(huán)數(shù)（個(gè)）1.0–2.00.5–1.015–200.

6、5–1.00.25–0.520–220.25–0.50.125–0.2522–240.05–0.250.025–0.12524–261.準(zhǔn)備:?第一鏈cDNA(SectionVII.A)?熱蓋PCR儀2.建立兩管100ul的擴(kuò)增體系，一個(gè)是實(shí)驗(yàn)組，另一個(gè)是對(duì)照組：2μl第一鏈cDNA(SectionVII.A)70μl蒸餾水10μl10XAdvantage?2PCR緩沖液2μl50XdNTP混合物2μl5’PCR引物2μl3’PCR引物10μl10X溶解液2μl50XAdvantage2聚合酶混合物100μl總體

7、積3.擴(kuò)增程序:?95°C30seca?xCycles95°C10secb68°C6min?68°C5mina參考TableIII設(shè)定PCR循環(huán)數(shù)。b擴(kuò)增程序每過(guò)一個(gè)循環(huán)時(shí)延伸時(shí)間增加5sec。例如，在第二輪循環(huán)中，延伸時(shí)間應(yīng)該是6min和5sec，如此疊加。4.對(duì)每個(gè)樣品取7μlPCR產(chǎn)物，使用0.25μg的1kbladderDNA分子量標(biāo)記在1.2%的瓊脂糖/EtBr進(jìn)行電泳進(jìn)行分析。注意:如果實(shí)驗(yàn)樣本沒(méi)有出現(xiàn)圖中所示的結(jié)果，請(qǐng)參考疑難解答指南(SectionX)。5.柱純化(SectionVII.C)后，可

8、將dscDNA在–20°C保存待用。2/4酵母雙雜交文庫(kù)構(gòu)建基本實(shí)驗(yàn)流程CHROMASPIN?+TE-400純化柱純化dscDNA1.準(zhǔn)備:?LD-PCR擴(kuò)增dscDNA(SectionVII.B;若沒(méi)有得到至少3μg的dscDNA，請(qǐng)使用更多的循環(huán)數(shù)重新做LD-PCR擴(kuò)增。)?醋酸鈉(3M)?冰乙醇(95–100%)2.每93ul的cDNA樣品使用一個(gè)CHROMASPI