酵母雙雜交試驗流程

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1、4月4日劃線配培養(yǎng)基TE/LIACPEG/LIAC配置培養(yǎng)基（YPDYPDA）取酵母細胞劃線30°生長3天。需要用品：三角瓶滅菌封口膜酵母提取物蛋白胨注：以下所有涉及菌的操作均需在超凈臺中完成。4月6號星期三（1）選擇2-3mm的單克隆（槍頭吸?。┓湃?-5ml的YPDA液體培養(yǎng)基，30°搖菌200rpm，8h7號下午開始，過夜培養(yǎng)，次日若菌液濃度達到標準，可先置于4度冰箱保存。需要用品：200ul滅菌槍頭、50ml三角瓶、YPDA液體培養(yǎng)基、搖床。4月7號星期四（2）吸取2.5-10ul酵母培養(yǎng)液，加

2、入25mlYPDA液體培養(yǎng)基，搖菌16-20h直到OD值0.15-0.3。下午4點開始8號8點結束Tips：由于第一次活化的菌夜?jié)舛炔灰唬颂幗ㄗh設置梯度，分別取2.5、5、10ul酵母培養(yǎng)液，加入25mlYPDA液體培養(yǎng)基（轉化5個以下質粒的話，25ml菌量就夠后續(xù)使用）。4月8號星期五（3）將菌液轉移至滅菌的50ml離心管中，用天平配平后，室溫下700g離心5分鐘。（4）棄掉上清，加入50ml新鮮的YPDA液體重懸菌體（由于離心轉速較低，沉淀易懸起來，故倒掉上清液時要小心操作）。（5）30°震蕩培養(yǎng)

3、，直到OD值達到0.4-0.5（3-5h）。8號8點開始下午一點結束進行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并準備好冰浴。（6）將上述菌液轉移至一個滅菌的50ml離心管中，用天平配平后，室溫下700g離心5分鐘。（7）棄掉上清，用30ml無菌水重懸菌體（小心操作）。（8）再次用天平配平后，室溫下700g離心5分鐘，棄去上清，加入1.5ml1.1xTE/LIAC重懸菌體。（9）將上述溶液轉移到滅菌的1.5mlEP管中，高速離心15s。（10）棄去上清，加入600ul1.1xTE/LIAC，感受態(tài)細胞制

4、備完成，置于冰上待用。需要物品：50ml滅菌離心管、50ml三角瓶、1.5mlEP管、5ml滅菌槍頭、1ml滅菌槍頭、滅菌ddH2O、YPDA液體培養(yǎng)基、1.1xTE/LIAC。1.1xTE/LIAC10ML10xTE1.1ml10xliac1.1mlDh2O8.8ml酵母轉化進行以下操作之前，配置適量的PEG/LIAC溶液，設置水浴鍋。（1）取適量的CarrierDNA，沸水浴變性5-10min，后立即置于冰水混合物中。（每轉一個質粒需準備5ulCarrierDNA，每10個樣多準備5ul）（2）取數(shù)

5、支滅菌的1.5mlEP管編號，置于冰水混合物上冷卻。（3）每個EP管中加入5ul變性后的CarrierDNA，再加入5ul待轉化的質粒DNA，用槍頭混勻。（4）向每個EP管中再加入50ul感受態(tài)細胞，輕敲管壁混勻（不要用槍頭吹打）。（5）向每個EP管中再加入500ulPEG/LIAC溶液，上下顛倒混勻（不要用槍頭吹打）。（6）30°水浴30min，每10min拿出來上下顛倒混勻（此過程中倒SD平板）。（7）向每個EP管中再加入20ulDMSO，上下顛倒混勻（多顛倒幾次，充分混勻）。（8）42°水浴15m

6、in，每5min拿出來上下顛倒混勻。（9）高速離心15s，用槍頭吸出上清（由于液體粘稠，不能直接倒）（10）加入1mlYPDA液體培養(yǎng)基，重懸菌體后，高速離心15s。（11）棄掉上清，加入1ml滅菌的0.9%NaCl溶液重懸菌體。（12）取100-200ul菌液涂板于相應的SD缺陷培養(yǎng)基上。需要物品：BD質粒（需提前準備）、carrierDNA、PEG/LIAC、DMSO、滅菌1.5mlEP管、YPDA培養(yǎng)基、0.9%無菌NACL、水浴鍋、滅菌10ul、200ul、1ml槍頭。PEG/LIACYPDAP

7、EG33508ml20g/l蛋白胨10XTE1ml10g/l酵母提取物10XLIAC1ml0.03g/l腺嘌呤20g/l葡萄糖報告基因的檢測1涂板于缺陷形SD固體培養(yǎng)基30°培養(yǎng)直至長出酵母細胞。2長出酵母細胞后，挑菌至缺陷型SD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)（3份）3搖菌至OD=0.6-1.04高速離心去上清，用無菌水重懸。5稀釋菌液形成4個梯度1:11:101:1001:10006分別涂板于雙缺，三缺，四缺的固體培養(yǎng)基、7觀察平板上是否有菌落長出