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《酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)流程(精)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫(kù)。
1、實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案模塊七蛋白質(zhì)之間的相互作用1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)以重組質(zhì)粒和酵母細(xì)胞為材料,學(xué)習(xí)檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用的基本原理和技術(shù)方法。主要介紹酵母雙雜交的基本原理與操作技術(shù);讓學(xué)生了解和掌握酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用;掌握酵母感受態(tài)的制備的基本原理和主要的操作步驟。2.實(shí)驗(yàn)原理1989年Fields和Song等人根據(jù)當(dāng)時(shí)人們對(duì)真核生物轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程調(diào)控的認(rèn)識(shí)(即細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄的起始需要轉(zhuǎn)錄激活因子的參與,提出并建立了酵母雙雜交系統(tǒng)。該系統(tǒng)作為發(fā)現(xiàn)和研究活細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用的技術(shù)平臺(tái),近幾年得到了廣泛的運(yùn)用和發(fā)展。相比于其它蛋白質(zhì)篩選系統(tǒng),
2、酵母雙雜交系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(diǎn):(1檢測(cè)在真核活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行,在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。(2作用信號(hào)是在融合基因表達(dá)后,在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的,省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。(3檢測(cè)結(jié)果是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng),因而可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)之間的微弱或暫時(shí)的相互作用。(4酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細(xì)胞類(lèi)型和分化時(shí)期材料構(gòu)建cDNA文庫(kù),能分析細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細(xì)胞部位及功能蛋白。(5通過(guò)mRNA產(chǎn)生多種穩(wěn)定的酶使信號(hào)放大。同時(shí),酵母表型、X-Gal及HIS3蛋白表達(dá)等檢測(cè)方法均很敏感。酵母雙雜交系統(tǒng)也具有一定
3、的局限性。首先,經(jīng)典的雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi),文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案因而限制了該系統(tǒng)對(duì)某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白的研究。酵母雙雜交系統(tǒng)的另一個(gè)局限性是“假陽(yáng)性”。在酵母雙雜交系統(tǒng)建立的初期階段,由于僅僅采用β-半乳糖苷酶這一單一的報(bào)告基因體系,這種報(bào)告基因的表達(dá)往往不能十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)乇豢刂?因此容易產(chǎn)生假陽(yáng)性。由于某些蛋白本身具有激活轉(zhuǎn)錄的功能或在酵母中表達(dá)時(shí)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用,使DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白在無(wú)特異激活結(jié)構(gòu)域的情況下也可被激活轉(zhuǎn)錄。另外某些蛋白表面含有對(duì)多種蛋白質(zhì)的低親和力區(qū)域,能與其他蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物,從而引起
4、報(bào)告基因的表達(dá),產(chǎn)生“假陽(yáng)性”結(jié)果。產(chǎn)生“假陰性”結(jié)果的原因可能有許多蛋白質(zhì)間的相互作用依賴(lài)于翻譯后加工如糖基化、磷酸化和二硫鍵形成,還有些蛋白的正確折疊和功能有賴(lài)于某些非酵母蛋白的輔助等?，F(xiàn)在的酵母雙雜交系統(tǒng)大都采用多種報(bào)告基因,如AH109酵母株含有三類(lèi)報(bào)告基因—ADE2、HIS3、MEL1/lacZ,這三類(lèi)報(bào)告基因受控于三種完全不同、異源性的GAL4-反應(yīng)元件和三類(lèi)啟動(dòng)子元件-GAL1、GAL2以及MEL1(如圖6-1-1。通過(guò)這種方法就消除了兩類(lèi)最主要的假陽(yáng)性,一類(lèi)是融合蛋白可以直接與GAL4結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合或者是在結(jié)合位點(diǎn)附近結(jié)合所帶來(lái)的
5、假陽(yáng)性;另一類(lèi)是融合蛋白和某種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后再結(jié)合到特定的TATA盒上所帶來(lái)的假陽(yáng)性。ADE2一種報(bào)告基因就已經(jīng)能夠提供較強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)選擇壓力,這時(shí)選擇性地使用HIS3報(bào)告基因,一來(lái)可以降低假陽(yáng)性率;二來(lái)可以控制篩選的嚴(yán)格性(如果需要篩選與誘餌蛋白具有較強(qiáng)結(jié)合的蛋白,就可以同時(shí)使用ADE2、HIS3兩種報(bào)告基因;如果只需要篩選與誘餌蛋白具有中等強(qiáng)度或較弱結(jié)合的蛋白,就可以使用ADE2或HIS3兩者中的一種。MEL1和lacZ分別編碼α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶,可以作用于相應(yīng)的底物文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案X-α-Gal和X-β-Gal使酵母變藍(lán)。其中,α
6、-半乳糖苷酶是外分泌酶,在酵母表面就能直接檢測(cè)到;β-半乳糖苷酶是內(nèi)分泌酶,需要將酵母破碎后才能檢測(cè)到。用藍(lán)斑顯示酵母細(xì)胞內(nèi)兩個(gè)蛋白的相互作用的方法不僅具有較高的敏感性,而且藍(lán)斑的深淺還可以反映兩個(gè)蛋白相互作用的強(qiáng)弱。隨著酵母雙雜交系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用,這一系統(tǒng)得到了不斷的完善及改進(jìn),除了經(jīng)典的雙雜交系統(tǒng)以外,同時(shí)也衍生出單雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)、反向酵母雙雜交系統(tǒng)、hSos/Ras募集系統(tǒng)(hSos/Rasrecruitmentsystems、泛素分裂系統(tǒng)(Split-ubiquitinsystems、雙誘餌系統(tǒng)(Dual-baitsystems等一
7、系列相關(guān)系統(tǒng),根據(jù)這些系統(tǒng)的不同特點(diǎn),可以分別應(yīng)用于蛋白質(zhì)與DNA、RNA的相互作用、蛋白質(zhì)復(fù)合體之間的相互作用、膜蛋白質(zhì)之間的相互作用、篩選阻斷蛋白間相互作用的藥物等一系列領(lǐng)域,對(duì)經(jīng)典的酵母雙雜交系統(tǒng)起到了很好的補(bǔ)充,并有力地推動(dòng)了酵母雙雜交系統(tǒng)的發(fā)展與應(yīng)用。酵母雙雜交系統(tǒng)的原理是利用轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的,即這些因子往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain,DB和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain,AD,它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。單獨(dú)的DB雖然能和啟動(dòng)
8、子結(jié)合,但是不能激活轉(zhuǎn)錄。而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子的這一特性,將BD與已知的誘餌蛋白質(zhì)X
