植物細(xì)胞培養(yǎng)--瑤瑤.doc

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1、植物細(xì)胞培養(yǎng)第一節(jié)理論基礎(chǔ)植物細(xì)胞培養(yǎng)（plantcellculture）是指在離體條件下對植物單個(gè)細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行培養(yǎng)使其增殖的技術(shù)。根據(jù)培養(yǎng)規(guī)模分為:小規(guī)模培養(yǎng)和大批量培養(yǎng)；根據(jù)培養(yǎng)方式分為:懸浮培養(yǎng)、單細(xì)胞培養(yǎng)等；根據(jù)要求產(chǎn)物分為:用于誘變的細(xì)胞培養(yǎng)和生產(chǎn)次生產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)。一、植物細(xì)胞培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)1、植物細(xì)胞的全能性植物細(xì)胞全能性是指植物體的毎一個(gè)活細(xì)胞具有發(fā)冇成完整個(gè)體的潛在能力。即植物體的每個(gè)細(xì)胞都具有該植物的全部遺傳信息，在適當(dāng)?shù)膬?nèi)、外條件下，一個(gè)細(xì)胞有可能形成一完整的新個(gè)體。在植物的生長發(fā)冇屮，從一個(gè)受精卵可產(chǎn)生具有完整形態(tài)和結(jié)構(gòu)機(jī)能的植

2、株，這是全能性，是該受精卵具有該物種全部遺傳信息的表現(xiàn)。同樣，植物的體細(xì)胞，是從合了有絲分裂產(chǎn)生的，也應(yīng)具有像合子一樣的全能性。但在完整植株上，某部分的體細(xì)胞只表現(xiàn)特定的形態(tài)和局部的功能，這是由于它們受到具體器官或組織所在環(huán)境的朿縛，但細(xì)胞內(nèi)固有的遺傳信息并沒有?喪失。因此，在植物組織培養(yǎng)屮，被培養(yǎng)的細(xì)胞、組織或器官，由于離開了整體,再加上切傷的作用以及培養(yǎng)基屮激素等的影響，就可能表現(xiàn)全能性，生長發(fā)冇成完整植株。2、植物細(xì)胞的脫分化和再分化脫分化：是指己分化的細(xì)胞在一定因素作用下，失去它原由的機(jī)構(gòu)和功能，重新恢復(fù)分裂機(jī)能。細(xì)胞脫分化的機(jī)構(gòu)通常形成愈傷組織。再分

3、化：通過脫分化形成的愈傷組織，在一定的培養(yǎng)條件下，可經(jīng)器官發(fā)生或胚狀體發(fā)生進(jìn)而發(fā)冇成完整的植株。由于這是由原來分化狀態(tài)的細(xì)胞脫分化培養(yǎng)示，再次分化，所以稱為再分化。二、培養(yǎng)基1.培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基的紐?成對植物細(xì)胞的生長和代謝物質(zhì)的生產(chǎn)彩響極大。典型的培養(yǎng)基有Murashige-Skoog（MS）,Linsmaier-Skoog（LS）,white和B5等四種。（1）無機(jī)鹽類：在無機(jī)鹽屮，磷酸根及氮源（NH4+或N03?）的含量對細(xì)胞的生長與物質(zhì)生產(chǎn)有明顯的影響。一些金屬離子如C“2+、Mg2+等的含量往往也有重要影響。⑵碳源：通常使川2—3%的蔗糖作碳源，也有

4、時(shí)使川匍萄糖或果糖。使川單糖的優(yōu)點(diǎn)是方便分析測定，且有助于細(xì)胞生長動力學(xué)分析。（3）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)：植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對植物細(xì)胞的生長和代謝物質(zhì)生產(chǎn)的影響十分大。分為兩大類：植物生長索類有2,4—D（二氯苯氧基乙酸）、IAA（耐味基醋酸）、NAA（蔡乙酸）,細(xì)胞激動素類有BA（茉基腺凜吟）、動力精和玉米素。（4）其他因素：植物細(xì)胞培養(yǎng)的影響因素還有培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)氣相紐?成（CO2和乙烯含量）、前體物質(zhì)、氨基酸、維生素及誘導(dǎo)劑等。2.培養(yǎng)條件（1）溫度：培養(yǎng)溫度對植物細(xì)胞生長及二次代謝產(chǎn)物生成有重要影響。通常采用25°C。（2）攪拌：在搖瓶實(shí)驗(yàn)屮，通常搖床的轉(zhuǎn)速取9

5、0—120r/mino（3）pH值：通過細(xì)胞膜進(jìn)行的H+離了傳遞對細(xì)胞的生冇壞境、生理活性來說是重要的。在培養(yǎng)過程屮，通常pH作為一個(gè)重要參數(shù)被控制在一定范圍內(nèi)。植物細(xì)胞培養(yǎng)的適宜pH值一般為5—6o(4)通氣：通氣是細(xì)胞液體深層培養(yǎng)重要的物理化學(xué)因了。好氣培養(yǎng)系統(tǒng)的通氣與混合及攪拌是相互關(guān)聯(lián)的。從溶氧速率考慮，以棉花塞最好，微孔硅橡膠塞次之，鋁箔寒最差。(5)光：光對植物有著特殊的作用。光照射條件不僅通過光照周期、光的種類、波長而且通過光強(qiáng)度的調(diào)節(jié)來影響植物細(xì)胞的生理特性和培養(yǎng)特性。研究表明，光調(diào)節(jié)著細(xì)胞屮的關(guān)鍵酶的活性，有時(shí)光能大大促進(jìn)代謝產(chǎn)物的生成，有時(shí)

6、卻起著阻害作用。(6)細(xì)胞齡：在培養(yǎng)過程的不同時(shí)期，細(xì)胞的生理狀況、生長與物質(zhì)生產(chǎn)能力羌異顯著。而且，使用不同細(xì)胞齡的種細(xì)胞，其后代的生長與物質(zhì)生產(chǎn)狀況也會大不一樣。通常，使用處于對數(shù)生長期后期或穩(wěn)定期前期的細(xì)胞作為接種細(xì)胞較合適。(7)接種量：在植物細(xì)胞培養(yǎng)屮，接種量也是一個(gè)煤響因索。在再次培養(yǎng)屮，往往取前次培養(yǎng)液的5—20%作為種液。由于接種量對細(xì)胞產(chǎn)率及二次代謝物質(zhì)的生產(chǎn)有一定影響，故應(yīng)根據(jù)不同的培養(yǎng)對象通過試驗(yàn)，確定其最大接種量。第二節(jié)單細(xì)胞分離?完整的植物器官分離單細(xì)胞采用機(jī)械法以及酶法?機(jī)械法：細(xì)胞不受到酶的傷害；不用質(zhì)壁分離；細(xì)胞產(chǎn)量低；細(xì)胞易破

7、。?酶法：細(xì)胞受到酶的傷害；要質(zhì)壁分離；細(xì)胞產(chǎn)量高；細(xì)胞不易破。?由培養(yǎng)組織分離單細(xì)胞步驟：?(1)誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；?(2)愈傷組織反復(fù)繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織的松散性；?(3)將愈傷組織在液體培養(yǎng)基屮培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物?注意：選擇適宜的外植體：幼胚、胚軸、子葉是最常使用的外植體。選擇適宜的培養(yǎng)基：較高濃度激素濃度，特別是生長素，必要的附加物質(zhì)，例如水解酪蛋片、Pro.Gino繼代多次，以獲得均勻一致疏松的愈傷組織。?第三節(jié)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)(cellsuspensionculture)?概念：懸浮培養(yǎng)是將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體培養(yǎng)基屮進(jìn)行培

8、養(yǎng)增殖的技術(shù)。?特點(diǎn)：?1、細(xì)胞可以不