雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng).doc

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1、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)雙熒光素酶報(bào)告基因測試∶結(jié)合螢火蟲和海洋腔腸熒光素酶先進(jìn)的共報(bào)告基因測試技術(shù)在用螢火蟲熒光素酶定量基因表達(dá)時(shí),通常采用第二個(gè)報(bào)告基因來減少實(shí)驗(yàn)的變化因素。但傳統(tǒng)的共報(bào)告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不夠便利,因?yàn)楦髯缘臏y試化學(xué),處理要求,檢測特點(diǎn)存在差異。Promega提供一種先進(jìn)的雙報(bào)告基因技術(shù),結(jié)合了螢火蟲熒光素酶測試和海洋腔腸熒光素酶測試。雙熒光素酶報(bào)告基因測試系統(tǒng),結(jié)合pRL載體系統(tǒng),表達(dá)第二個(gè)報(bào)告基因海洋腔腸熒光素酶,在單管中進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因測試,快速,靈敏,簡便。系統(tǒng)

2、還提供PLB裂解液,用來裂解在多孔板中培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞,不需操作單個(gè)樣品。對于正在使用螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因載體的研究人員。雙熒光素酶報(bào)告基因測試系統(tǒng)將使他們立即體會到該系統(tǒng)的便利。介紹????雙報(bào)告基因用于實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中作相關(guān)的或成比例的檢測,通常一個(gè)報(bào)告基因作為內(nèi)對照,使另一個(gè)報(bào)告基因的檢測均一化。檢測基因表達(dá)時(shí)雙報(bào)告基因通常用來瞬時(shí)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞，帶有實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因的載體共轉(zhuǎn)染帶有不同的報(bào)告基因作為對照的第二個(gè)載體。通常實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因偶聯(lián)到調(diào)控的啟動子,研究調(diào)控基因的結(jié)構(gòu)和生理基礎(chǔ)。報(bào)告基因表達(dá)活力的相對改變與偶聯(lián)調(diào)

3、控啟動子轉(zhuǎn)錄活力的改變相關(guān)，偶聯(lián)到組成型啟動子的第二個(gè)報(bào)告基因，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對照,使測試不被實(shí)驗(yàn)條件變化所干擾。????通過這種方法,可減少內(nèi)在的變化因素所削弱的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性,比如,培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目和活力的差別,細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率。????使用螢火蟲熒光素酶,結(jié)合氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT),β-半乳糖苷酶(β-Gal),或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的雙報(bào)告基因,近幾年已普遍使用。但這些雙報(bào)告基因組合削弱了熒光素酶操作的優(yōu)勢,比如熒光素酶測試和定量可在幾秒鐘內(nèi)進(jìn)行,但CAT,β-Gal和GUS測試法,則在定量前需

4、要長時(shí)間的保溫。另外,這些報(bào)告基因受限于它們的靈敏度和線性應(yīng)答范圍,必須注意不要超過這些范圍,內(nèi)源性細(xì)胞活力也會干擾這類報(bào)告基因的使用。許多類型的細(xì)胞有內(nèi)源β-Gal或GUS表達(dá),不利于準(zhǔn)確定量報(bào)告基因表達(dá),胞內(nèi)去乙酰酶活力干擾CAT活力測試。盡管在高溫下預(yù)處理細(xì)胞裂解液(1,2),會降低內(nèi)源性β-Gal和CAT測試的干擾，但這些處理也會快速失活熒光素酶。因此,在此類雙報(bào)告基因檢測中,必須以不同的步驟分別處理共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解液。????理想的雙報(bào)告基因方法應(yīng)該使用戶能夠以螢火蟲熒光素酶所具有的速度,靈敏和線性范

5、圍對同一樣品中的兩個(gè)報(bào)告基因同時(shí)測定。這在傳統(tǒng)的報(bào)告基因,如CAT,β-Gal和GUS是不可能的,由于它們測試化學(xué),處理要求所固有的局限。相反,結(jié)合螢火蟲(Photinuspyralis)和海洋腔腸(Renillareniformis)雙熒光素酶，Promega的雙熒光素酶報(bào)告基因測試(DLR)系統(tǒng)可滿足這些要求，在單管中完成這些測試。雙熒光素酶報(bào)告基因測試化學(xué)?熒火蟲和海洋腔腸熒光素酶都具有生物發(fā)光報(bào)告基因的卓越的測試特點(diǎn),但它們在進(jìn)化上的起源不同,因此,具有不同的酶學(xué)結(jié)構(gòu)和底物要求。這些差別用來發(fā)展了DLR

6、測試化學(xué),選擇性地區(qū)別這兩種發(fā)光報(bào)告基因的活力。螢火蟲熒光素酶是一個(gè)61kDa單亞基蛋白質(zhì),酶活力不需翻譯后修飾(3,4),在翻譯后即可作為遺傳報(bào)告基因。在ATP,Mg2+和O2存在下，通過甲蟲熒光素的氧化反應(yīng)發(fā)光(圖1)。在常規(guī)反應(yīng)條件下,熒光素的氧化發(fā)生時(shí),以熒光素-AMP作為中間體,轉(zhuǎn)換非常緩慢。結(jié)果,在底物和酶混合后,測試化學(xué)產(chǎn)生"閃爍"的光,并迅速衰減。專利化的測試試劑,定量螢火蟲熒光素酶活力,摻入了輔酶A(CoA),增強(qiáng)快速酶轉(zhuǎn)換來提高反應(yīng)動力學(xué)(5),導(dǎo)致持續(xù)的"閃爍"發(fā)光信號(圖2)。圖1由螢火

7、蟲和Renilla熒光素酶催化的生物發(fā)光海洋腔腸熒光素酶，一個(gè)36kDa單亞基蛋白質(zhì)，純化自天然來源的Renillareniformis(6)，含有3%的碳水化合物，但是和螢火蟲熒光素酶一樣，酶活力不需翻譯后修飾，在翻譯后即可作為遺傳報(bào)告基因。海洋腔腸熒光素酶所催化的發(fā)光反應(yīng)，利用O2和海樣腔腸熒光素(coelenterazine)(圖1)。當(dāng)用DLR測試化學(xué)作實(shí)驗(yàn)時(shí)，海洋腔腸熒光素酶反應(yīng)的動力學(xué)產(chǎn)生閃爍型發(fā)光信號，在檢測過程中緩慢地衰減(圖2)。在DLR測試系統(tǒng)中，用單個(gè)裂解液分步測定螢火蟲和海洋腔腸熒光素酶

8、活力。在完成螢火蟲熒光素酶活力("實(shí)驗(yàn)"報(bào)告基因)的測定后，螢火蟲發(fā)光被快速湮滅，并同時(shí)激活海洋腔腸熒光素酶的發(fā)光反應(yīng)("對照"報(bào)告基因)。因此，DLR測試系統(tǒng)整合了兩個(gè)測試化學(xué)，對共表達(dá)的兩個(gè)報(bào)告基因作快速地定量，酶來自轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液，或無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)。????螢火蟲熒光素酶測試的線性范圍延伸達(dá)酶濃度的8個(gè)數(shù)量級，可測定≤1fg(大約10-20摩爾)的實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因酶(圖3A)。