雙熒光素酶報(bào)告基因檢測

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1、為了適應(yīng)公司新戰(zhàn)略的發(fā)展，保障停車場安保新項(xiàng)目的正常、順利開展，特制定安保從業(yè)人員的業(yè)務(wù)技能及個(gè)人素質(zhì)的培訓(xùn)計(jì)劃雙熒光素酶報(bào)告基因檢測　　雙熒光素酶檢測啟動子活性試驗(yàn)服務(wù)簡介　　雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)?zāi)壳坝蓛蓚€(gè)主要的應(yīng)用方向，第一是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用，轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動子中的特異順序結(jié)合，這些特異性的序列被稱為順式因子，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式因子實(shí)現(xiàn)共價(jià)結(jié)合，從而對基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的作用。雙熒光素酶報(bào)

2、告基因?qū)嶒?yàn)是檢測這類轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動子中的特異順序結(jié)合的重要手段，第二是研究微小RNA(microRNA)對于靶基因的調(diào)控，通過生物信息學(xué)方法預(yù)測microRNA潛在的靶基因以及干預(yù)位點(diǎn)序列，并設(shè)計(jì)合適的microRNA質(zhì)粒或干預(yù)片段，同時(shí)構(gòu)建靶基因的報(bào)告基因質(zhì)粒，二者同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這是確定microRNA是否能影響靶基因的首選研究方法。實(shí)驗(yàn)方案：　　1）構(gòu)建一個(gè)將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報(bào)告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic或pMIR-REPORTLuciferase質(zhì)粒目的-通過該培訓(xùn)員工可對保安行

3、業(yè)有初步了解，并感受到安保行業(yè)的發(fā)展的巨大潛力，可提升其的專業(yè)水平，并確保其在這個(gè)行業(yè)的安全感。為了適應(yīng)公司新戰(zhàn)略的發(fā)展，保障停車場安保新項(xiàng)目的正常、順利開展，特制定安保從業(yè)人員的業(yè)務(wù)技能及個(gè)人素質(zhì)的培訓(xùn)計(jì)劃　　2）將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或目的細(xì)胞。如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比?！　?）加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光素，通過檢測熒光的強(qiáng)度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有

4、作用。　　雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的一些影響因素及注意事項(xiàng)　　轉(zhuǎn)載請注明來自丁香園發(fā)布日期：XX-03-2613:43文章　　分享到：收藏夾新浪微博騰訊微博開心網(wǎng)豆瓣社區(qū)人人網(wǎng)　　關(guān)鍵詞：雙熒光素酶報(bào)告基因載體點(diǎn)擊次數(shù)：24521．報(bào)告基因檢測受多種因素影響，因此同批次樣品檢測值也可能出現(xiàn)浮動。所以實(shí)驗(yàn)一般需要做3個(gè)或3個(gè)以上復(fù)孔，并且引入另一個(gè)報(bào)告基因作為內(nèi)參?！　?．細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不宜過長，12-36h內(nèi)最好；長時(shí)間培養(yǎng)后，細(xì)胞難裂解。　　3．雙熒光素酶報(bào)告基因的載體選擇：　　a)螢火蟲熒光素酶建議選取pGL-3或pGL-4

5、的載體或自己構(gòu)建相應(yīng)的載體；　　b)海腎熒光素酶建議選取phRL-TK或pGL-4代載體或自己構(gòu)建相應(yīng)的載體。建議海腎載體不使用強(qiáng)啟動子，而選用中等強(qiáng)度的啟動子。目的-通過該培訓(xùn)員工可對保安行業(yè)有初步了解，并感受到安保行業(yè)的發(fā)展的巨大潛力，可提升其的專業(yè)水平，并確保其在這個(gè)行業(yè)的安全感。為了適應(yīng)公司新戰(zhàn)略的發(fā)展，保障停車場安保新項(xiàng)目的正常、順利開展，特制定安保從業(yè)人員的業(yè)務(wù)技能及個(gè)人素質(zhì)的培訓(xùn)計(jì)劃　　4．雙熒光素酶報(bào)告基因的載體比例：根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體情況調(diào)整。建議作一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)來調(diào)整，螢火蟲熒光素酶檢測發(fā)光值大于海腎熒光素酶發(fā)光值

6、的比例較好?！　?．最適反應(yīng)溫度：室溫。各個(gè)組分都需要調(diào)整到室溫。　　6．雙熒光素酶反應(yīng)體積：20ul-100ul-100ul，底物量可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整，但一定要保證底物過量，不然會造成檢測結(jié)果出現(xiàn)大的偏差　　7．細(xì)胞裂解產(chǎn)物存放：常溫不超過6小時(shí)；-20℃一個(gè)月；-80℃半年　　8．裂解產(chǎn)物與底物混合：要求混合快速、混合時(shí)間一致，避免熒光素酶衰變的影響?！　?．發(fā)光半衰期：　　a)單熒光素酶檢測試劑盒，螢火蟲熒光素酶的發(fā)光半衰期約12min　　b)雙熒光素酶檢測試劑盒，螢火蟲熒光素酶的發(fā)光半衰期約9min，海腎熒光素酶的發(fā)

7、光半衰期約2min　　10．檢測結(jié)果　　檢測前應(yīng)檢測孔板或空管的發(fā)光值，作為儀器發(fā)光背景值，Modulus多功能檢測儀的儀器背景值應(yīng)小于100；　　樣品檢測發(fā)光值應(yīng)該遠(yuǎn)大于儀器背景值，例如10000。如果樣品發(fā)光值過于接近儀器背景值，說明樣品中熒光素酶過少，需要考慮轉(zhuǎn)染量、轉(zhuǎn)染效率、裂解效率等因素?！　‰p熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)目的-通過該培訓(xùn)員工可對保安行業(yè)有初步了解，并感受到安保行業(yè)的發(fā)展的巨大潛力，可提升其的專業(yè)水平，并確保其在這個(gè)行業(yè)的安全感。為了適應(yīng)公司新戰(zhàn)略的發(fā)展，保障停車場安保新項(xiàng)目的正常、順利開展，特制定安保從業(yè)人員

8、的業(yè)務(wù)技能及個(gè)人素質(zhì)的培訓(xùn)計(jì)劃　　雙熒光素酶報(bào)告基因測試∶結(jié)合螢火蟲和海洋腔腸熒光素酶先進(jìn)的共報(bào)告基因測試技術(shù)在用螢火蟲熒光素酶定量基因表達(dá)時(shí),通常采用第二個(gè)報(bào)告基因來減少實(shí)驗(yàn)的變化因素。但傳統(tǒng)的共報(bào)告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不夠便利,因?yàn)楦髯缘臏y試化學(xué),處理要求,檢測特點(diǎn)存